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干货分享 | 热启动酶耐热机制全面解析

常规PCR技术因能够快速扩增任何已知的DNA片段而被广泛应用于分子生物学的各个领域。但常规型PCR技术容易出现引物二聚体或错配引起的非特异性扩增等现象,造成实验结果的不准确性。热启动型PCR能够很好的解决上述问题,是最常用的提高PCR特异性的方法。


热启动酶介绍


热启动酶(
Hot start enzyme主要利用酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶的活性,加热至变性温度时修饰物失活,释放酶活,从而使PCR反应得以正常进行。目前市面上常用的DNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、配体修饰抗体修饰等,不同的热启动修饰方法原理上有所区别,各有优劣势。


化学法

DNA聚合酶的化学法修饰,一般采用化学小分子如酸酐等有机物与聚合酶上的侧链氨基酸(赖氨酸)通过化学反应相互作用,使酶低温时失去酶活,温度升高后,酸酐与氨基之间的化学键断裂,酶活释放,从而达到热启动效果。化学修饰可有效封闭酶的活性,操作简单,但酶活性释放速度较慢,依赖温度激活DNA聚合酶,能有效抑制非特异性产物,可在室温下配置反应体系,且对PCR反应buffer要求较高。

图片.png

1. 化学法修饰热启动酶原理图


配体法

配体法修饰,主要借助核酸适配体封闭酶活。顾名思义,核酸适配体一般指一类具有特异性识别功能的单链核酸分子,可以是RNA也可以是DNA,长度一般为25~60个核苷酸。作为一种寡核甘酸序列的识别分子,作用的靶分子范围广泛,从无机金属的小分子到生物领域的大分子。这些适配子可以形成特定的空间构象,从而在表观功能上与抗体类似。对蛋白质或其他小分子物质具有高度特异性、亲和力。核酸适配体通过非共价键与DNA聚合酶结合,进而抑制聚合酶在非许可温度下的聚合反应。一般核酸适配体的筛选所需周期较短,整个过程能够依赖自动化,简便快捷。

图片.png

2. 配体法修饰热启动酶原理图

抗体法

抗体法热启动酶一般考虑使用DNA聚合酶抗体封闭酶活性,使其在低温时处于无活性状态,在加热至变性温度时抗体变性,解除封闭从而释放活性,可以大大避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。另一方面针对低丰度基因,封闭抗体在避免预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合的同时,增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率,从而保证低丰度基因的有效检出,大大提升反应灵敏度和扩增效率。

图片.png

3. 抗体法修饰热启动酶原理图


1. 热启动酶常见修饰方法优劣势比较

酶活封闭类型

化学修饰

配体修饰

抗体修饰

原理

化学小分子和DNA聚合酶活性中心结合封闭酶活

核酸适配体通过非共价键作用与聚合酶结合封闭酶活

DNA聚合酶抗体与聚合酶结合封闭酶活

酶活释放条件

温度:大于95 ℃

时间:10-15 min

温度:大于60 ℃

时间:1-5 min

温度:大于70 ℃

时间:30 s-5 min

优点

酶活性维持更加稳定且无任何外源DNA污染,性价比较高。

不需要激活步骤,稳定性高,减少样品降解的可能性。

酶激活时间短,保证酶活,亲和力强,灵敏度高。

缺点

酶激活时间较长可能会影响酶的活性,导致PCR产物的产量降低。

核酸配体是一种可逆抑制剂,不如化学修饰法稳定,特异不够强。

抗体修饰是一种动态平衡,抗体生产成本高,试剂配比优化时间长。

以上简单介绍了热启动酶的常见类别和各种热启动方法的优劣势,其中化学修饰物不能够批量合成,而且需要较长的激活时间聚合酶才能释放酶活。配体修饰DNA聚合酶只在20-25°C效果较好,到40°C时,聚合酶的活性就被释放出来,特异性不好;而抗体法修饰热启动酶对应的封闭效果最佳,酶活释放速度快,从而大大降低PCR反应时间,是目前IVD市场上应用较多的一种热启动酶改造方法


热启动酶应用


热启动酶在热启动
PCR的应用方面较为广泛
不仅有效防止非特异性PCR产物,而且在较难扩增的PCR反应如单拷贝基因的扩增、多重PCR和超长片段的扩增等应用尤为突出,大大改观了传统PCR技术的局限性。在病原微生物检测、遗传病诊断和法医鉴定等各个领域等实际应用中颇为广泛。在应对全球爆发的新冠疫情方面,热启动酶亦贡献颇多。目前市面上应用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR检测试剂的核心酶基本都是抗体法热启动酶


相关产品


类型

名称

货号

规格

价格(元)

抗体法热启动酶

Hieff Unicon® Hotstart J-Taq DNA polymerase

13086ES60/76/90

100 U/500 U/

5000 U

询价

Hieff Unicon® Hotstart D-Taq DNA Polymerase

10715ES01/03/25/60

100µl/1mL/25mL/

100mL

1652/13252/127852/887652

封闭抗体

Hieff® anti-Taq DNA Polymerase Antibody Taq酶单克隆抗体

31301ES60/80/90/92/93/94

100 µg/1/5/10/100/1000 mg

1153/3653/14653/26353/231753/1969552

Hieff® anti-exonuclease of Taq Antibody Taq酶5'→3'外切酶单克隆抗体

31302ES60/80/90/92/93/94

100 µg/1/5/10/100/1000 mg

1153/3653/14653/26353/231753/1969552



参考文献


【1】Michael R. Green, Joseph Sambrook. Hot Start Polymerase Chain Reaction (PCR)[J]. 2018, 2018(5):pdb.prot095125.

【2】Kermekchiev, M. B . Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2003, 31(21):6139-6147.

【3】Chou Q , Russell M , Birch D E , et al. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications[J]. Nucleic Acids Research, 1992, 20(7):1717-1723.

【4】刘峰涛,柴立辉,马远方.DNA聚合酶适配子6-10提高定量PCR的特异性[J].临床检验杂志,2009,27(03):164-166.


HB200508