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探讨rRNA去除的方法与必要性

遗传中心法则表明,DNA是生物体内遗传信息的载体。遗传信息在精密的调控下从DNA转录成RNA,再传递到蛋白质。因此RNA被认为是DNA与蛋白质之间生物信息传递的“桥梁”,在研究转录组信息中占有着重大的作用


背景介绍

转录组(transcriptome)是指在某一特定的生理条件下,细胞、组织或者生物体内所有的转录产物的集合,即转录出来的所有RNA总和,包括编码RNA(即mRNA)和ncRNA(tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA)等不同类型的RNA分子。在这之中核糖体RNA (rRNA) 约占RNA总量的 80%,是最多的一类RNA,通常这类RNA分子量比较大且代谢不活跃,种类包括:原核生物中5S rRNAs、16S rRNAs和23S rRNAs三种,真核生物中5S rRNAs、5.8S rRNAs、18S rRNAs和28S rRNAs四种。

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图1. RNA分类图



rRNA的“作用”

随着人类基因组计划(HGP)和DNA元件百科全书计划(ENCODE)的完成,人们发现在人类基因组中大部分DNA都可以转录成RNA,但是仅有1.5%的核苷酸序列用于蛋白质的编码,剩余不编码蛋白质的的非编码RNA(ncRNA),被认为是基因组转录噪音。这种转录组噪音(无效信息)基本全部来源于丰度最高的成员——rRNA。

测序的目的就是为了更多的获得生物信息但是rRNA这个在RNA中最丰富的成员却只能提供非常少的转录本的信息,且检测到过多的rRNA会掩盖其它基因的表达丰富度;因此,通常在测序之前从RNA样品中除去rRNA,rRNA去除的效率也被视为最大化读取到转录物的关键因素

图片.png
 

图2. 人类组织或细胞总RNA中各种RNA分布饼状图


rRNA的“去除法”

目前rRNA去除的方法主要有两种,一种是通过DNA探针或者RNA探针杂交捕获rRNA再用磁珠吸附去除的方法,这种方法称为Ribo-Zero-seq;另一种是利用特异性核酸酶处理的方法提取RNA,称为RNA酶消化法。两种方法对应的原理与区分如下所示:


方法一(RNA酶消化法
去除流程特异性探针(区分物种)与rRNAs杂交——RNase H消化rRNAs——DNase I消化探针——其他RNA富集纯化
市场占比:在市场现有品牌中占据绝大多数
优势样本起始量要求低;rRNA残留量更低
缺点:其操作较复杂;暂无混合样本效果验证;
流程图

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方法二(Ribo-Zero-seq)
去除流程生物素标记探针与rRNAs杂交——链霉亲和素磁珠去除探针与rRNAs——其他RNA富集纯化
市场占比:Illumina RiboZero与Thermo RiboMinus系列使用该方法
优势:磁珠法,操作简单;可应用于混合样本;
缺点样本起始量要求高(一般为1 μg);rRNA残留量相对方法1略高;
流程图

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更多关于rRNA去除方法请点击:NGS mRNA建库完全攻略—从mRNA纯化到注意事项


rRNA的“高效去除”

Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)利用RNase H消化法去除人、小鼠、大鼠总RNA中的核糖体RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA(如FFPE RNA)均具有良好的rRNA去除效果。可用于高通量测序分析mRNA和非编码RNA,也可用于cDNA合成或其它下游应用。

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图3. 1μg 293T 总RNA 进行 rRNA 去除,利用 qPCR 对比去除前后 rRNA 基因和 mRNA 基因的Ct值变化
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图4. 分别以1μg 人、小鼠、大鼠总RNA为样本,试剂盒去除rRNA后建库,测序获得rRNA残留%数据


产品信息

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参考文献

1. Adiconis X , Borges-Rivera D , Satija R , et al. Corrigendum: Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples[J]. Nature Methods, 2014, 11(2):210-210.
2. Zhao W , He X , Hoadley K A , et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling[J]. Bmc Genomics, 2014, 15(1).
3. Petrova O E , Garcia-Alcalde F , Zampaloni C , et al. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes[J]. Scientific Reports, 2017, 7:41114.