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认识qPCR文章金标准——MIQE

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      qPCR实验灵敏度非常高,一个条件的不同就可能导致实验结果发生改变。为了增加实验可靠性、重复性,按照同一标准对实验条件进行描述就很有必要了。MIQE就是这一国际化标准。


MIQE的由来:2009年,Stephen A等人发表文章《The MIQE Guidelines:Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments》,文中规定了qPCR结果想要发表需要提供的最少信息,文章一经发表,就得到了大众的认可,现已成为国际化标准。所以想要发表文章的小伙伴就需要先了解下MIQE内容。


       MIQE规定:文章投稿时需要同时提交一个清单。该清单分9个部分、85个参数。其中标记为“E”表示必须(essential),标记为“D”表示建议(desirable)。(点击查看清单)


      RT-qPCR通常分为以下五个步骤:1. 样本采集、处理和制备;2. 核酸质量控制;3. 反转录;4. qPCR;5. 数据分析。下面,我们看下每一步所需信息。



01
样本采集、处理和制备



1.采集:来源是哪个物种、器官、组织。并对样本进行简要说明。例如:肿瘤样本描述肿瘤细胞组成比例。


2.处理:提取RNA是用新鲜组织还是冰冻组织,如果冰冻,是如何冰冻的,冻了多长时间。


3.制备:样本如何均质化的,样品目标密度、生理状态、遗传复杂性如何,处理了多少生物量。



02
核酸的质量控制



1.提取:操作环境、试剂、耗材中有无RNase。


2.定量:用何种方法做定量,量是多少。一篇文章中需要用同一种方法来定量RNA。


3.gDNA去除:描述gDNA污染程度。RNA样本是否经过DNase处理(包括DNase类型和反应条件)。


4.质量评估:质量评估方法和结果。推荐使用凝胶电泳或者微流控芯片rRNA分析。


5.杂质残留:杂质残留检测结果。例如:通过稀释样本做反转录来检测PCR抑制剂的存在,或者使用SPUD等抑制试验。



03
  反转录



必须要详细描述逆转录的方法和试剂。包括:RNA模板量,引物种类,酶的类型与数量,反应体系以及反应的时间和温度。



04
qPCR



1.基因信息:

基因的数据库登陆信息,目标核酸的结构(如RNA的茎环结构)。目的基因的长度。


2.引物信息:序列和浓度,结合位点。


3.染料或探针:染料种类、探针序列等。


4.实验设计:内参基因的选择、复孔数、阴性阳性对照。


5.反应体系及反应条件:聚合酶的名称和浓度,模板量,缓冲液化学组成,反应体系总量,反应温度及循环数。


6.仪器耗材:塑料耗材的透明度如何,反应容器为单一管、带还是板,制造商是哪家。当使用板时,还需提供板的密封方法。



05
数据分析



数据分析包括审查原始数据,评估质量和可靠性,以及结果分析。在做数据分析时需要提供如下信息:


1.标准曲线:对每一对引物制作标准曲线来分析扩增效率。


2.实验组和对照组的Cq值


3.数据计算方法和归一化方法


4.数据重复性如何


5.统计方法和计算软件



06
术语统一



1.qPCR指的是实时荧光定量PCR,RT-qPCR指反转录qPCR;


2.用于归一化的基因叫做参考基因,而不是管家基因;


3.TaqMan 探针应该被称为水解探针;


4.FRET是荧光共振能量转移探针(fluorescence resonance energy transfer probe)的总称,LightCycler-type探针应称为双杂交探针。


5.不用单词“quantitation”,而使用“quantification” ;


6.描述用于量化的PCR循环数不用Ct、Cp及TOP等单词,建议使用“Cq”来描述。


结语

MIQE指南提供了发表被认可的 RT-qPCR 实验结果所需考虑的所有参数,本篇文章仅罗列了其中的关键条目,作为了解MIQE的引子。鼓励大家深度阅读原文,以期获得理想的实验结果。


查看原文,请点击此处