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《小翊实验手账》荧光定量PCR之引物篇

 荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种技术手段。它通过在PCR体系中添加荧光基团来显示DNA产物的累积情况,从而达到对PCR过程进行实时监控的目的。并且可以通过数据分析计算出起始模板量,这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。

荧光定量PCR实验因为灵敏度高所以经常是差之毫厘谬以千里,所以在实验过程中,我们需要注意诸多细节,谨慎操作。小伙伴们看到这里就要着急了,我怎样才能做好qPCR实验,拿到实验结果,发表高分文章,走上人生巅峰呢?

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引物设计的好坏,关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否。所以正确设计出引物是qPCR成功的第一步。

首先,我们知道qPCR是特殊的PCR,所以,qPCR的引物设计要满足一般PCR引物设计的原则,见下表。

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除此之外,qPCR引物设计需要额外注意几点。

1. 扩增片段长度

扩增效率随着扩增子长度减小而增大,建议扩增产物最好在80-200bp的范围,若产物小于75bp,扩增子很难与引物二聚体区分开,若产物大于300bp,则会因为酶活降低导致扩增效率降低。如果你的扩增产物因为实验需求一定要在500-600bp的话,做qPCR实验时要选用三步法扩增,不要用快速两步法扩增。

2. 区分isoform:

对于同一个基因名来说,可能会有不同的isoform。isoform指的是,对于同一个基因,它的mRNA有多种不同剪接方式,这个时候表达出来的的蛋白可能会有不同,所以小伙伴们在设计实验的时候,一定要想清楚自己要做的是哪一个isoform。

举个“栗子”:比如说一个基因有四种不同的isoform,如果大家想要检测的是四种不同剪接方式转录本之和,那么设计引物时就要针对这四个isoform的共有序列设计。如果只想检测其中一种isoform,那就要在这个isoform与其他三个isoform的不同序列位置设计引物。

3. 跨内含子设计引物:

跨越内含子设计引物可以区分并且规避基因组DNA污染。设计引物时需要让一端或两端引物跨越内含子,以人基因组来说,平均每个基因有8.8个外显子和7.8个内含子,80%的外显子长度小于200bp,少于10%的内含子长度在1100bp以上,不到0.01%的内含子长度小于20bp。(Sakharkar MK et al. Distributions of exons and introns in the human genome[J].In Silico Biol. 2004;4(4):387-93.)例如外显子长度200bp,为了兼顾扩增子长度,我们可以把上游引物设置在外显子1和外显子2的中间,下游引物设置在外显子2的位置(如下图所示)。

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好啦,以上是引物设计需要注意的问题,在设计好引物之后,我们需要在NCBI上进行BLAST检验,来确保产物的特异性。

理论知识很丰富了,现在让我们实战一下吧!

第一步:选择靶基因

打开NCBI,选择“Gene”,输入想要检测的基因名称,我们以人基因“ALAD”为例。

 

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会出现很多搜索结果,我们选择需要的种属来源,即“human”,如果你知道Gene ID(每个基因有且只有一个特定的ID,类似于人的身份证),也可以根据Gene ID来选择。这里我们选择搜索结果中的第一个。

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点开之后,会出现很长的页面,耐心往下拉,找到“mRNA and Protein(s)”栏下的NM编号,不同的NM编号,代表不同的isoform。选择想要检测的那一个。
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确定NM号点击后,可以看到这个isoform的一些基本信息。

例如:      3.jpg

以及此基因的序列,如下图所示。此序列就是设计引物时对应的模板。



例如:       
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第二步:用软件设计引物

引物设计软件有很多,例如oligo7、Primer5、Clone Manager等,以及很多在线网站,例如Primerbank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)、

Primer3plus(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

NCBI 的Primer BLAST等。在手头没有安装合适的软件的时候,我们可以选择在线网站设计引物。

小翊以NCBI网站里的Primer BLAST为例讲解。

 

打开NCBI,在页面底端有Primer BLAST。
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点击Primer BLAST后,在弹出来的界面里粘贴模板序列或者输入基因序列号。另外需要设置“上下游引物位置”和“扩增子长度”。最主要的设置就是这两点了,另外还有“物种名称”、“数据库”等其他选项可以设置。
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设置好之后,点击页面左下角的“get Primer”

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弹出如下界面,点击“Check”

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出现多对引物,选择合适的引物即可。

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第三步:BLAST检验

在NCBI主页的右边找到BLAST入口。

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点击后,选择“Nucleotide BLAST”。

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在界面里输入引物序列,选择对应数据库。进行BLAST。

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以上是对qPCR引物设计的介绍,相信小伙伴们通过小翊的介绍,对如何设计引物已经有一定的了解啦。