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One Step RT-qPCR Probe技术在RNA病毒研究的应用

1. 精准检测,至关重要


RNA病毒的宿主众多,涵盖几乎所有类型的生命体。很多RNA病毒让宿主们谈虎色变,具有非常强的侵略能力,会严重影响宿主生命活动。我们常听到的RNA病毒均臭名昭著之辈,如艾滋病病毒、流感病毒、登革热病毒、烟草花叶病毒、噬菌体等。

 

我们以HIV病毒急性感染期感染过程,可以看下HIV病毒精准检测对于诊断和治疗效果评估的重要性。

HIV急性感染期可分为病毒感染期、隐蔽期及病毒血症峰,是病毒检测的重要时期。

新英格兰杂志进行过一项急性感染期的前瞻性研究,研究表明1.94%的急性HIV-1感染随访者出现临床症状或体征;其中发热、头痛、周身不适等临床症状大多出现在病毒血症峰高峰前,心动过速、淋巴结肿大、头颈部异常等体征大多出现在病毒血症峰高峰时。可见如果通过症状和体征来判断病毒感染情况,必然是错过了最佳的治疗期,因为此时病毒已经产生了一定量的复制。因此在最早期阶段,高灵敏地检测出病毒,甚至精准地确认病毒的拷贝数,就可以为最大程度的控制病毒复制提供重要参考。

 

如何精准地检测到病毒呢(定性)?是否可以有效判定出有多少个病毒呢(定量)?

我们以登革热病毒的检测为例,来了解一步法RT-qPCR Probe技术。 

2 一步法RT-qPCR Probe技术介绍

一步法RT-qPCR(One-Step reverse transcription-quantitative PCR)用于以RNA为起始模板的定性和定量分析,将RNA逆转录合成cDNA的过程与靶标基因的PCR扩增于一管内依次进行。利用荧光标记的Probe来监控PCR扩增产物的变化,进而判断RNA初始量的技术叫做一步法RT-qPCR Probe技术。探针是一类荧光分子标记的寡核苷酸序列,根据碱基互补配对原则与PCR扩增产物结合,合理的设计可分辨出单个碱基变异。

2.1 登革热病毒的基因分型检测

登革热病毒是RNA病毒,分为1-4型血清型,Den-1、Den-2、Den-3和Den-4,不同血清型会引起不同严重程度的疾病1、2】,严重者致出血致死。因此,有效区分血清型非常必要。

当前主要检测技术包括检测血液中病毒核酸的分子诊断技术和测定中和抗体,前者是当前唯一能够判定病毒血清型的方法。而基于核酸的分子诊断技术中,One Step RT-qPCR技术因检测耗时短,工作量较小,结果可靠,且能够对样本病毒载量进行定量,而占据主导地位。

第一步:快速判定是否是登革热病毒感染:

One Step RT-qPCR Probe检测思路3】:选取四种血清型共有的保守区域,因四种血清型的探针结合区域(保守区域)有1个碱基不同,可设计两类Taqman探针,5’端用6-FAM荧光基团标记的taqman探针检测Den-1和Den-3(黑色线条),5’端用JOE荧光基团标记的taqman探针检测Den-2和Den-4(绿色线条)。也即是多重实时PCR。

image.png 

第二步:确认为登革热病毒感染后,区分感染的血清型:

One Step RT-qPCR Probe检测思路:比对Den-1型、Den-2型、Den-3型、Den-4型序列,筛选出各自的保守区序列,用以设计引物和探针。

2.2 登革热病毒的个数检测

以已知数量的噬菌斑形成单位的登革热病毒分离株梯度稀释,以提取得到的RNA作为标准品,进行一步法RT-qPCR实验,制作标准曲线。之后根据待测血清中得到的Ct值,判定病毒的噬菌斑形成单位数。

2.3登革热病毒检测时,几种基于核酸的分子诊断技术的比较

至今,最初的RT-PCR渐日落西山,处于成熟期的RT-qPCR风头正盛,日益崛起的数字PCR大有可期。RNA病毒的分子检测技术可谓革新不断。一步法RT-qPCR Probe技术无需开管即保证了qPCR对产物的实时监控和产物分析,最大程度的避免了污染(相对于RT-PCR),同时,具备更高样本检测通量(相对于二步法RT-qPCR)。

 

分子技术类型

One Step RT-PCR

One Step RT-qPCR SYBR Green I

One Step RT-qPCR Probe

实验原理

依据四种血清型序列保守性,通过扩增子大小区分

依据四种血清型序列保守性,需要借助溶解曲线得到的Tm值大小和凝胶电泳进行判定特异性

依据四种血清型序列保守性,根据Ct值判定

灵敏度

检测通量

污染概率

实验重复性


3 总结

病原体(病毒)的精准检测对于疾病的筛查及治疗效果评估非常重要,借助分子生物学技术可以精准检测病原体(病毒),其中的一步法RT-qPCR技术可被广泛用于RNA病毒类型判定、病毒亚型判定、病毒定量及病毒突变体等方面,广泛用于食品安全、动物疫病、疾病诊断与治疗效果评估等临床与公共卫生等领域。

 

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[1] Burke DS, Nisalak A, et al. A prospective study of dengue infections in Bangkok. Am J Trop Med Hyg. 1988 Jan;38(1):172-80.

[2] Eili Huhtamo, et al. Molecular Epidemiology of Dengue Virus Strains from Finnish Travelers. Emerg Infect Dis. 2008 Jan; 14(1): 80–83. 

[3] Callahan JD, Wu SJ, Dion-Schultz A , et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. J Clin Microbiol. 2001 Nov;39(11):4119-24.