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    分子酶专栏之等温扩增酶与原核DNA聚合酶

 一.经典的原核DNA聚合酶

在细菌中,三种DNA聚合酶Pol IPol IIPol III共同作用,实现DNA的复制。这三种酶具有相同的5-3的延伸活性,只是延伸的速率不同。同时它们都具有3-5方向的核酸外切酶活性,这保证了DNA复制过程中的保真性,也就是所谓的矫正活性(proofreading)。除此之外,DNA Pol I还具有5-3方向的核酸外切酶活性。这个活性很重要,它可以在cDNA第二链合成过程中去除RNA引物,还可以进行DNA链的切除修复(excision-repair)。

 

DNA 聚合酶I and Klenow片段

野生型DNA Pol I常被用来去除3突出末端或补齐带有5突出端的双链DNA。不过,它的5-3外切酶活性使其并不适用于所有的DNA聚合酶”场景,比如需要在连接额外的linker后,才能进行3凹末端的补齐,不然突出的5端会被切掉;而且它也不适合双脱氧测序过程中的单链DNA扩增。不过好在,人们很早之前就发现,蛋白水解酶消化DNA Pol I可以得到两个独立的片段,分子量分别为7636 kDa。其中大片段就是我们熟悉的Klenow片段,保留DNA聚合酶活性和3-5的外切酶活性,小片段只有5-3外切酶活性。由此可见,单纯的Klenow片段显然更具有应用价值,当然现在的商用Klenow片段都是大肠杆菌重组表达的产物,不然的话,用蛋白水解方式得到的Klenow免不了污染小片段。

 

T4 DNA聚合酶

T4 DNA聚合酶需要在模板和引物存在条件下发挥两种活性:当反应体系中不含或dNTP不足时,表现出强烈的3-5外切酶活性;当dNTP存在时,表现正常的5-3 DNA聚合酶活性。不像大肠杆菌DNA Pol IT4 DNA聚合酶没有5-3方向外切酶活性,所以可以大胆地用于5突出末端的双链DNA的补齐,制备平末端产物。对于双链的DNAT4 Pol的外切酶效率大约为40 bp/min,而对于单链DNA,它的切割活性达到惊人的4000 bp/min。不过,更令人吃惊的是,在标准反应体系中,它的DNA聚合速度可达15000 bp/min,这已经比任何的PCR酶都快了。不过,考虑到T4 DNA Pol具有矫正活性,这个合成速度实在令人匪夷所思。

 

二.等温扩增酶

PCR技术是上世纪最伟大的发明之一,它的出现极大地满足了人们日益增长的核酸扩增需求。而作为PCR的有益补充,等温扩增技术自从上世纪末出现以来越来越受到大家的重视,主要应用于微量的全基因组扩增和检测应用。大多数的等温扩增需要用到具有强烈链置换能力的DNA聚合酶,这些酶可以在复制的时候置换下游的DNA链从而不需要模板变性。常见的具有链置换能力的DNA聚合酶有A家族的Bst DNA聚合酶以及来自B家族的phi 29,前者最经典的应用是“环节到等温扩增”技术(图1),后者被广泛地用于微量模板扩增的“滚环扩增技术”(图2)。Phi 29作为B家族成员,显著的特点是具有扩增矫正活性,但同时扩增效率就比Bst要差,不过根据最新报告,有人将phi 29Sso7d之类的DNA双链结合蛋白相融合,可极大地提升扩增能力。

相比于phi 29Bst的应用开发比较早,商业化的Bst通常是其大片段产物,活性比全长的蛋白高。Phi29完全不耐热,最适反应温度是30℃左右,Bst酶可耐热到75℃,最适反应温度是65℃。

 

 

1. LAMP反应原理示意图

 

 

2. 基于滚环扩增的微量DNA等温扩增过程

 

三.DNA聚合酶与测序技术漫谈

DNA聚合酶的发展和应用,从一开始就与DNA测序技术息息相关,主要原因是目前所有的测序技术归根到底还是利用DNA聚合酶这一分子机器,在DNA扩增过程中记录延伸的dNTP种类。Sanger发明的第一代DNA测序技术——双脱氧核苷酸测序技术,最初使用的是Klenow片段,但是这个酶对双脱氧核苷酸的掺入效率比较低,后期有人基于T7 DNA聚合酶进行改造,得到对双脱氧核苷酸不敏感的突变体,并开发成商业化的测序酶Sequenase 2.0TM。目前最新的Sanger法测序酶是基于Taq酶的突变体Thermo SequenaseTM和基于高保真酶9°N的突变体TherminatorTM

在二代测序平台中,测序所用的dNTP多为修饰的、带有长链和荧光基团的dNTP类似物,这就对DNA聚合酶提出了更高的要求。比如一种9°N DNA聚合酶的突变体,在其掌域和手指域靠近活性位点区域具有多个特异性的点突变,这些突变可以改善9°N聚合酶的dNTP类似物的掺入。其他的NGS平台,如ThermoIon Torrent和罗氏的454平台开发了使用天然dNTP和野生型Bst DNA聚合酶的技术,使用Bst的一个优点是可以利用它的链置换能力,突破复杂二级结构的扩增。

近几年开始受到广泛的关注的三代测序,是一种能够进行长片段测序的技术,目前最长的reads可至惊人的40 kb,特别适用于具有广泛重复序列的植物基因组测序。三代测序平台不多,最有名的是Pacific Biosciences公司的RSRSII平台,以及最新款Sequel平台。目前这些平台测序工作还是需要用到聚合酶,既然它能测这么长的序列,所用的聚合酶必然需要能够扩增超长片段这一技能。PacBio使用的聚合酶就是经过突变,去除了核酸外切酶活性的phi 29。当然,为了进一步增强其持续扩增能力,还可以将此phi 29突变体融合一个双链结构蛋白。另外一个方案是突变9°N DNA聚合酶并添加一个人工“钳”来稳定其余DNA双链的稳定。不过我个人更看好对phi 29的改造,因为其具有链置换能力,对复杂模板的扩增还是有一定优势的。

 

至此,分为三个篇章来讲述的DNA聚合酶专栏告一段落。限于篇幅,其实还有很多有意思的DNA聚合酶相关的知识点我们没有涉及,比如另一个重要的商业化高保真聚合酶系列 VentTMDeepVentTM、优化PCR过程的添加剂选择等。关于这些,大家可以从文后附带的文献找到更多的你感兴趣的点。

 

参考文献:

1. Terpe, Kay. Overview of thermostable DNA polymerases for classical PCR applications: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.Appl Microbiol Biotechnol (2013) 97:10243-10254.

2. Sharma, Ritu., etc. A novel method for whole blood PCR without pretreatment. Gene (2012) 501: 85-88.

3. Aschenbrenner, Joos., etc. DNA polymerases and biotechnological applications.Curr Opin Biotechnol (2017) 48:187-195

4. Shanbhag, Vinit., etc.Family A and B DNA Polymerases in Cancer: Opportunities for Therapeutic Interventions.Biolog (2018) 7(1): 1-16.

5. Modified DNA polymerases for PCR troubleshooting.Microbial genetics (2017) 58:133-142.

6. Pan, Wenjing., ect. DNA polymerase preference determines PCR priming efficiency.BMC Biotechnology (2014) 14:10.

 

 



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