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    吐血整理外泌体标记大法(附原文献)

Exosome(外泌体)是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡,具有典型的脂质双分子层结构;参与细胞之间的交流,物质的运输以及正常生理过程的维持,此外还与疾病的产生有关。
对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪,有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前对于外泌体的标记方法有很多种,包括亲脂性的染料和膜渗透型的化合物等。
下面小编就为大家罗列下近几年文献发表中有关外泌体染色的方法。
 
一、亲脂性染料 :PKH-67(green)/PKH-26(red)
染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光,主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞失踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67,PKH-26具有更长的半衰期,标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。
 
将PKH67标记的神经细胞外泌体与b.End3 细胞共培养后的荧光图
图片引自:Xu B, Zhang Y, Du X-F, et al. Neurons secrete miR-132-containing exosomes to regulate brain vascular integrity. Cell Research. 2017;27(7):882-897.
 
二、亲脂性羰花青染料(carbocyanine dyes):DiI/DiD/DiO/DiR
DiI, DiO, DiDDiR是一系列亲脂性的荧光染料,可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。这些环境敏感性荧光染料在进入细胞膜之前荧光非常弱,当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强。且具有消光系数高、极性依赖性、激发态寿命短等特点。一旦进入细胞膜后,可在整个细胞膜上扩散,最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。
下面小编整理了使用这类染料对外泌体进行标记的文献。
DiI
 
将DiI标记的外泌体注射入小鼠海马齿状回(DG)区,分别观察第3、6和20天的荧光,对比可以发现外泌体在皮质层发生了很大的迁移。
图片引自:Zheng T, Pu J, Chen Y, et al. Plasma Exosomes Spread and Cluster Around β-Amyloid Plaques in an Animal Model of Alzheimer’s Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 2017;9:12.
DiD
 
上图显示的是将DiD标记的外泌体与PC12细胞孵育3H后,用共聚焦观察的结果。
图片引自:Tian T, Zhu YL, Zhou YY, Exosome uptake through clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis and mediating miR-21 delivery. J Biol Chem. 2014 Aug 8;289(32):22258-67
DiR
 
体内静脉注射DiR标记的外泌体,24H后进行成像观察,结果如上图所示。
图片引自:Wiklander OP, Nordin JZ, OLoughlin A, et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.J Extracell Vesicles. 2015 Apr 20;4:26316.
DiO
 
使用ExoChip-chambers捕获不同样品中的exosome,然后使用DiO进行外泌体染色,通过观察荧光的强弱对不同来源样品中的外泌体进行定量分析。
图片引自:Kanwar SS, Dunlay CJ, Simeone DM, Nagrath S. Microfluidic device (ExoChip) for On-Chip isolation, quantification and characterization of circulating exosomes. Lab on a chip. 2014;14(11):1891-1900. 
 
三、渗透型的化合物标记法:CFSE/CFDA/Calcein-AM
1、CFSE:
羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯,常称为 CFSE,可被动扩散进入细胞。 这种试剂没有颜色和荧光,直至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团,产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。 琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应,形成稳定且能用醛固定剂固定的荧光偶联物。
 
使用CFSE进行标记的外泌体可以用于后续FACS、NTA和显微镜观察使用。
图片引自:van der Vlist EJ1, Nolte-t Hoen EN, Stoorvogel W, et.al.Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry,Nat Protoc. 2012 Jun 14;7(7):1311-26.
2、Calcein-AM:
在传统的Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团,增加了疏水性,使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后,Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein,从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。
 
 
上图展示的是通过钙黄绿素染色的方法对获得的外泌体完整性进行检测。如果外泌体完整性很好,发出绿色荧光的钙黄绿素就可以保留在外泌体中,反之,则会从外泌体中泄漏出来。
 
图片引自:Warren D. Gray, Adam J. Mitchell, Charles D. Searles, An accurate, precise method for general labeling of extracellular vesicles, MethodsX. 2015; 2: 360–367.
 
四、利用外泌体表面的巯基(thiol group)对外泌体进行标记:
C5-maleimide-Alexa 488 / C5-maleimide-Alexa 633
 
上图中左图显示的是maleimide-633标记的外泌体与肺成纤维母细胞共培养的结果;右图展示的是EV488标记的外泌体与Hela细胞共培养的结果。
图片引自:Roberts-Dalton HD1, Cocks A, Falcon-Perez JM,et al. Fluorescence labelling of extracellular vesicles using a novel thiol-based strategy for quantitative analysis of cellular delivery and intracellular traffic.Nanoscale. 2017 Sep 21;9(36):13693-13706.
 
五、通过物理的方法对外泌体进行标记:
1、放射性标记物:99mTc-HMPAO
 
 
 
     外泌体标记示意图:将99mTc-HMPAO与外泌体进行孵育,99mTc-HMPAO进入外泌体后被内源的谷胱甘肽转换成亲水的形式,从而滞留在外泌体中,达到标记的目的。右侧是将标记后的外泌体输入小鼠体内后观察到的外泌体分布图。
图片引自:Hwang DW, Choi H, Jang SC, et al. Noninvasive imaging of radiolabeled exosome-mimetic nanovesicle using 99mTc-HMPAO. Scientific Reports. 2015;5:15636.
2、量子点微囊泡标记:Ag2Se @锰量子点
Ag2Se @锰量子点一体化具有优良的近红外(NIR)荧光和磁共振(MR)成像能力,可用于MV体内的高分辨率双模式实时有效的标记跟踪。是一种低毒高灵敏、非侵入性的实时活体成像的方法。
Ag2Se @锰量子点是通过控制Mn+与Ag2Se纳米晶体在80℃的NaOH溶液反应制成,其具有约1.8纳米的超小尺寸,良好的水分散性,高NIR荧光量子产率和12.87毫-1-1高纵向弛豫。超小尺寸使他们能够通过电穿孔直接和有效地装入的MV。该方法可以用于不同来源的微囊泡标记,对微囊泡的不会有太多损伤。
 
上图展示的是使用Ag2Se @锰量子点对巨型囊泡(MV)进行标记的方法
图片引自: Jing-Ya Zhao, Gang Chen, Yi-Ping Gu, et al. Ultrasmall Magnetically Engineered AgSe Quantum Dots for Instant Efficient Labeling and Whole-Body High-Resolution Multimodal Real-Time Tracking of Cell-Derived Microvesicles. Journal of the American Chemical Society 2016 138 (6), 1893-1903
 
 
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细胞培养上清外泌体快速抽提试剂盒
HieffTM Quick exosome isolation kit(for Cell Culture Media)
41201ES25/50
25 mL/50 mL
2155/3855
血清/血浆外泌体快速抽提试剂盒
HieffTM Quick exosome isolation kit( for Serum/Plasma)
41202ES64
150 mL
2155
DiI (DiIC18(3)) 细胞膜橙红色荧光探针
40726ES10
10mg
398
DiO (DiOC18(3)) 细胞膜绿色荧光探针
40725ES10/25
10mg/25mg
488/988
DiD Perchlorate (DiIC18(5)) 细胞膜红色荧光探针
40758ES25
25mg
988
DiR Iodide (DiIC18(7)) 细胞膜深红色荧光探针
40757ES25
25mg
988
 
 
 


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