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    一文让你掌握蛋白电泳中的PAGE胶

 

几乎每个实验小白刚进实验室的时候都会做到PAGE实验,但是PAGE实验中用到的胶,你们真的了解吗?它分离蛋白的原理是什么?PAGE胶里有哪些组分,这些组分的作用是什么?平常实验室手工配出来的胶跟在公司购买的胶有什么差别?带着这些疑问跟着小翊一起学习蛋白电泳中的PAGE胶吧!

 

1.什么是PAGE?它的原理是什么?

 

 

 

PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术,主要用于蛋白质分离。聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(scrylamideAcr)和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamideBis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶,这里的催化剂指的是过硫酸钠(AP),加速剂指的是四甲基乙二胺(TEMED)利用PAGE胶进行蛋白分离的依据是电泳迁移率和PAGE胶的分子筛作用。

PAGE胶一般由不连续的缓冲系统组成,包括浓缩胶和分离胶,浓缩胶的浓度较小,孔径较大,可以将样品浓缩至一个狭窄的区带,之后样品到达浓度较高的分离胶,实现蛋白的分离。根据分离蛋白质的类型PAGE可分为Native PAGESDS PAGE

Native PAGE是指在不加入SDS和巯基乙醇等变性剂的情况下,对保持活性的蛋白质进行电泳,可使蛋白质保持天然的形状和电荷,蛋白分离的依据是电泳迁移率和PAGE胶的分子筛作用,其分离状况跟蛋白质的分子量大小、形状和携带电荷量相关。Native PAGE电泳之后仍能保持蛋白质酶等生物大分子的生物活性,对其鉴定具有重要意义。

SDS PAGE一般是指在PAGE胶的配制、电泳样本、电泳缓冲溶液中加入阴离子去垢剂SDS的电泳技术,SDS可断裂分子内和分子间的氢键,使蛋白分子去折叠,破坏蛋白的二、三级结构。在蛋白样品中加入SDS,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合形成蛋白-SDS胶束,其所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,大大消除了不同分子间的电荷差异和结构差异,基本只跟蛋白质分子量有关。

2PAGE胶是如何配制的?

1)配胶

PAGE胶的配制包括配胶和灌胶两个步骤。要配制聚丙烯酰胺凝胶,首先就是要拿到具体的配方,根据表1所列举配方准备好配胶的试剂。

1.PAGE凝胶配制的参考配方,具体配方各个实验室根据其实验条件和实验需求会有所不同

组分作用

组分名称

危险性

10 mL分离胶

4 mL浓缩胶

8%

10%

12%

5%

定容剂

H2O

无危害

5.3 mL

4.9 mL

4.4 mL

2.46 mL

单体/交联剂

Acr- Bis291

Arc:经皮肤和呼吸道传染,毒性可累积,不易排毒

Bis:影响中枢神经系统

2 mL

2.5 mL

3 mL

0.5 mL

缓冲溶液

1.5 M Tris-HCl/SDS pH 8.8

SDS对呼吸道有刺激作用

2.5 mL

2.5 mL

2.5 mL

1(pH 6.8)

催化剂

10% AP

对黏膜上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性

0.1 mL

0.1 mL

0.1 mL

40 uL

加速剂

TEMED

强神经毒性

6 uL

6 uL

6 uL

4 uL

根据需要检测的蛋白大小选择合适浓度的凝胶,按照图1依次加入各组分,配制好分离胶,振荡混匀。

2)灌胶

玻璃胶板和制胶夹的下沿对齐后,夹紧,然后垂直卡在架子上,灌胶。先灌分离胶,灌入后加入1 mL异丙醇/dd H2O,放置15-45 min使其凝固。在分离胶固定好之后,倒掉上层的异丙醇/dd H2O,再按照表1配制浓缩胶,倒入玻璃板中间,再插入梳子,等候30 min,这样PAGE凝胶就配制好了。

配制好的凝胶,最好立即用于电泳实验;或置于密封袋中, 4℃储存,时间不要超过1星期。

3.预制胶与传统自配胶的优劣势比较

说了这么多PAGE胶的知识,相信大家对PAGE胶都有了一定的了解了,现在的PAGE胶除了实验室自己配制,也可以购买市面上配制好的PAGE胶,称之为预制胶。随着劳动力的增值,人们越来越倾向于购买品质稳定的预制胶进行实验。相对于传统自配胶,预制胶具有以下优点:

1)节省实验人员的宝贵时间:不用再配制N种溶液,还要灌胶、等胶凝固。

2)品质稳定:大规模生产的预制胶质量稳定,重复性好,可以有效避免自己配胶时好时坏的情况。

3)避免直接接触有毒物质:PAGE胶的成分大多数都是有毒的

听到这里是不是有点心动了呢? 

(更多详情点击)http://www.yeasen.com/Productfeature/2027.htm

附表:不同浓度的预制胶适合的蛋白质分子量范围

原则上高分子量用低浓度胶,低分子量蛋白用高浓度胶;如果分离蛋白范围较广,选用梯度预制胶会达到较好的分离效果。

货号

产品名称

分离范围

36230ES10

8%-20%高分辨率梯度预制胶,10孔

6.5-250 KDa

36231ES10

4%-20%高分辨率梯度预制胶,10孔

3.5-250 KDa

36232ES10

8%高分辨率预制胶,10孔

40-200 KDa

36233ES10

10%高分辨率预制胶,10孔

20-160 KDa

36234ES10

12%高分辨率预制胶,10孔

15-85 KDa

36235ES10

15%高分辨率预制胶,10孔

10-50 KDa

订购信息

货号

产品名称

规格

36230ES10

Precast Protein Improve Gels, 8%-20%, 10 wells 8%-20%高分辨率梯度预制胶10

1盒(10块)

36231ES10

Precast Protein Improve Gels, 4%-20%, 10 wells 4%-20%高分辨率预制胶10

1盒(10块)

36232ES10

Precast Protein Improve Gels, 8%, 10 wells 8%高分辨率预制胶10

1盒(10块)

36233ES10

Precast Protein Improve Gels, 10%, 10 wells 10%高分辨率预制胶10

1盒(10块)

36234ES10

Precast Protein Improve Gels, 12%, 10 wells 12%高分辨率预制胶10

1盒(10块)

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Precast Protein Improve Gels, 15%, 10 wells 15%高分辨率预制胶10

1盒(10块)

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