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    RIPA裂解液,读这些就够了!

 

1.什么是RIPA裂解液?

RIPA裂解液(Radio Immunoprecipitation Assay Lysis buffer,放射免疫沉淀法裂解缓冲液)是一种传统的可用于裂解细胞或组织的快速裂解液,其原理为利用表面活性剂等裂解细胞膜(包括核膜),从组织或细胞中抽取可溶性蛋白。RIPA裂解液裂解后得到的蛋白一般可直接用于常规的WBIPco-IP等实验。

2.RIPA裂解液里有什么?

 

    RIPA裂解液的配制方法有很多种,主要包括裂解成分、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂三种组分。裂解成分可通过破坏细胞膜和蛋白间的相互作用等方式裂解组织或细胞;蛋白酶抑制剂可有效抑制各类蛋白酶的活性,避免蛋白过度降解;磷酸酶抑制剂可有效抑制去磷酸化作用。各组分具体作用见表1

   值得注意的是,由于RIPA裂解液中含有一些稳定性相对较弱的酶类抑制剂,故应放在-20℃保存。其中PMSF的稳定性极弱,半衰期只有0.5 h,所以必须现配现用。

1.RIPA裂解液里的成分及其作用

分类

名称

作用

有效裂解成分

Sodium Deoxycholate

阴离子去垢剂;能够有效破坏多种蛋白间的相互作用

1%Triton X-100

非离子型表面活性剂;溶解脂质,增加细胞膜的通透性

0.1% SDS

表面活性剂和还原剂;有增溶作用

1% NP-40

温和的非离子型去垢剂;可破坏掉细胞膜,获得胞浆蛋白,对核膜的破坏作用较弱

蛋白酶抑制剂

PMSF

抑制丝氨酸蛋白酶:胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶

抑制半胱氨酸蛋白酶:木瓜蛋白酶

Leupeptin

抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶:胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B

Aprotinin

抑制丝氨酸蛋白酶:抑制纤维蛋白溶解、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶

不抑制凝血酶或凝血因子X

Pepstatin

抑制天冬氨酸蛋白酶、胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶、多种微生物酸性蛋白酶

EDTA-Na

抑制金属蛋白酶

磷酸酶抑制剂

NaF

有效抑制去磷酸化作用

Na3VO4

有效抑制去磷酸化作用

Beta-glycerophosphate

有效抑制去磷酸化作用

Na2PO4

有效抑制去磷酸化作用

3.RIPA裂解液有哪些种类?

目前市面上的裂解液根据其主要裂解成分等不同大致分为强、中、弱等几类。表2列举了翊圣生物提供的四种RIPA裂解液,可满足不同实验需求。

2.翊圣生物的四种RIPA裂解液及其基本特点

货号

20101

20114

20115

20118

名称

RIPA裂解液(强)

RIPA裂解液(弱)

RIPA裂解液(中)

免疫印迹及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液

主要用途

WB

IP

WB

IP

Co-IP

WB

IP

WB

IP

Co-IP

有效裂解成分

1%Triton X-100

1% Sodium Deoxycholate

0.1% SDS

1% NP-40

0.25% Sodium Deoxycholate

1% NP-40

0.5% Sodium Deoxycholate

0.1% SDS

1%Triton X-100

裂解强度

温和

温和

提取膜蛋白

很好

一般

较好

一般

提取胞浆蛋白

很好

很好

很好

很好

提取核蛋白

很好

较好

较好

较好

提取胞浆磷酸化蛋白

很好

很好

很好

很好

提取细胞核转录因子

很好

很好

很好

很好

含蛋白酶抑制剂

含磷酸酯酶抑制剂

4.如何选择合适的RIPA裂解液?

     如果您只是要做普通的WBIP或者co-IP,我们建议您使用免疫印迹及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液(20118),该裂解液在裂解细胞或组织后一般不会形成粘滞的透明状DNA团块,不必采用超声处理就可进行下一步操作。同时,该裂解液还适用于磷酸化蛋白的WB检测。

     如果使用免疫印迹及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液(20118)的效果不是很好,那您的蛋白可能比较特殊,我们建议您可以尝试另外几种裂解液。如果您的蛋白是难溶性的蛋白,建议您可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,如RIPA裂解液(/);如果您在做IP实验的时候发现背景很高,即有很多非特异性蛋白被IP下来,这时候您需使用裂解强度较强的裂解液,比如RIPA裂解液(/)。反之,如果您发现目的蛋白无法IP下来,则说明您使用的裂解液强度过强,此时需使用裂解强度较弱的裂解液,比如RIPA裂解液()

5. RIPA裂解液适用于哪些细胞?

几乎适用于所有实验室培养的动物细胞和各种组织。包括各种悬浮细胞、贴壁细胞及动物组织等。

6. 如何判断细胞的裂解程度?

细胞裂解:加入RIPA,充分裂解的细胞,没有细胞沉淀,很粘稠。如果像浑浊的水一样粘性很小则可能是裂解液得量加太多导致的;相反,如果RIPA裂解液后出现胶状物体,离心不能沉淀则可能是蛋白太多,RIPA裂解液加入的量太少导致的。

组织裂解:先将组织剪成细小的碎片,之后利用匀浆器或超声破碎的方法,镜检显示细胞破碎率大于90%,同时组织已经完全裂解,没有明显的小组织块。之后按照细胞裂解的步骤进行裂解,裂解程度的判断标准与细胞裂解一致。

RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清进行后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,如NF-κBp53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。

7. RIPA储存出现白色沉淀,为什么?

一般是由于裂解液中SDS在储存的时候沉淀析出导致,这时只需将裂解液放置于37℃水浴加热后恢复室温即可使用。

8. RIPA裂解液可以获得细胞中的不同蛋白吗? 

RIPA裂解液提取的是全蛋白,包括核蛋白、浆蛋白、膜蛋白等。如果要提取特定的蛋白(如:核蛋白、膜蛋白)则可利用专门提这类蛋白的试剂盒进行提取。

 

纸上得来终觉浅,觉知此事要躬行。小翊在这里给出的建议仅供大家参考,具体裂解液的选择和使用,还需要根据您自己的实验需求和实验效果选择最适合您实验的RIPA裂解液。

9.订购信息

产品名称

产品编号

规格

储存

价格(元)

RIPA Lysis Buffer (Strong) RIPA裂解液(强)

20101ES60

100 mL

-20℃

228

RIPA Lysis Buffer (Weak) RIPA裂解液(弱)

20114ES60

100 mL

-20℃

228

RIPA Lysis Buffer (Medium) RIPA裂解液(中)

20115ES60

100 mL

-20℃

228

Lysis Buffer for WB/IP Assays

免疫印迹及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液

20118ES60

100 mL

-20℃

228

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产品编号

规格

价格(元)

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20123

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