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    Western Blot 快速实验攻略

 

 

 

 

Western Blot实验原理


蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。

 

试剂准备


详见文末附录。

实验步骤


1. 样本制备

1)融解RIPA裂解液(什么是RIPA,RIPA成分有哪些,RIPA的适用性等问题,在文末有具体讲解),混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

2)贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应无没有明显的细胞沉淀。

悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成0.5-1×106个细胞/管,然后再裂解。

组织样本:按照每20 mg组织加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。

3)充分裂解后,10000-14000g离心3-5min,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

【注】:RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,例如NF-kappaB、p53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。

2. 蛋白定量

1)配制BSA标准品体系

标准品稀释液为蛋白样品的溶解液,原则上蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。BSA标准品体系配制可参考下表。

表1 BSA标准品体系配制(微孔板检测,线性范围20-2000μg/mL)*

Vial

稀释液体积(μL)

2mg/mL BSA体积(μL)

BSA终浓度(μg/mL)

A

0

100

2000

B

25

75

1500

C

50

50

1000

D

125

75

750

E

150

50

500

F

350

50

250

G

375

25

125

H

395

5

25

I

400

0

0=Blank

*如用比色皿检测,每管需加100μL标准品,按3个重复计算,每个浓度至少需配制300μL。

2)各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。

3)每孔加入200μL BCA工作液,振荡30s充分混匀。盖上微孔板,37℃孵育30min。

4)冷却到室温,在酶标仪上的540-595nm波长范围处检测吸光度,其中562nm波长为最佳。

5)根据BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数),绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/mL;Y-最终的OD562nm)。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

3. 蛋白电泳

1)剪开包装取出预制胶,撕去胶板底端橙色胶纸,将预制胶固定在电泳槽中,内槽加满tris-glycine电泳缓冲液,外槽液面低于内槽5-10mm,双手按住梳子左右部位将其平稳缓慢(一定要慢,否则会将胶齿拔断或拔歪)拔出。

2)在室温或不超过37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3)按照每4 μL蛋白样品加入1μl 5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液的比例,混合蛋白样品和5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4)100℃或沸水浴加热 3-5min,以充分变性蛋白,之后冷却至室温备用。

5)在每个样品孔中上样20-40µg蛋白,并在1个孔中上样蛋白marker,盖上电泳槽盖,打开电源,推荐使用低压100V,跑15min,之后换高压150V跑,通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6)电泳后取出胶板,用刀在侧边硅胶处,沿着两片玻璃缝隙切开硅胶,即可打开玻璃板;取胶时,需在胶和玻璃条之间,沿着玻璃条划一刀,防止发生粘连。掰开两板,将胶取出,此时蛋白会从凝胶上慢慢扩散,因此不要保存在凝胶里,要迅速进行下一步的转移操作。

4. 转膜与封闭

1)将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。(如果检测小分子蛋白质,可省略该步骤,因小分子蛋白容易扩散)。

2)依据胶的大小剪取膜和滤纸6片,放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min,如用PVDF膜,需参照说明书,先用纯甲醇浸泡1-2min,再孵育于预冷的转膜缓冲液中。(膜的选择:0.45μm孔径,用于一般蛋白;0.2μm孔径,用于分子量小于20kD蛋白;0.1μm孔径,用于分子量小于7kD蛋白)

3)装配转移三明治:海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵,每层放好后,用试管赶尽气泡。

4)将转移槽置于冰浴中,放入三明治,膜靠近阳极,胶靠近阴极,加入转移缓冲液,插上电极,100V,1h(电流约为0.3A)。

5)转膜结束后,切断电源,取出膜。

6)将膜浸没在5mL丽春红染色液中,置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长,直待膜上显示出蛋白条带。注:如果没有出现染色条带,则表示转膜失败,可能需要重新转膜或重新上样电泳。

7)清洗:取出膜,用蒸馏水,PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照,大概冲洗2~3次,每次5min。

8)脱色:将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min;倒去洗脱液,再重复一次。

9)清洗:再用蒸馏水清洗膜2~3次,每次5min。

10)将膜置于25mL封闭缓冲液中,在室温下孵育1小时。

11)用5mL TBST洗涤三次,每次15min。

 

5. 抗体孵育与检测

1)将膜和一抗(按照产品应用推荐稀释度)置于10mL一抗稀释缓冲液中在4°C下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2)用5mL TBST洗涤三次,每次15min以去除残留的一抗。

3)将膜和二抗(按照产品应用推荐稀释度)置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4)用5mL TBST洗涤三次,每次15min。

5)最后一次洗膜的同时,按照ECL超敏试剂盒说明书,新鲜配制发光工作液。

6)用平头镊取出膜,搭在滤纸上沥干洗液,勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液(125μL发光工作液/cm2膜)中,与发光工作液充分接触。室温孵育3min,准备立即压片曝光。

7)用镊子夹起膜,搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

8)在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上,将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜,去除气泡和皱褶,可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内,蛋白带面向上。

9)暗房内压X光胶片,分别曝光不同的时间,如数秒到数分钟。显影冲洗。(从刚开始的10s曝光时间中可以看出适当的曝光时间。由于检测反应的动力学特征,在孵育后信号立即变得最强,但在随后的2小时内会减弱)

常见问题

 

附录:Western Blot快速实验试剂准备

1. 各类缓冲液

1)电泳缓冲液:10xTris-Glycine-SDS电泳缓冲液(20319ES76),或参考配方1×:25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.1% SDS, pH 8.3

2)电转缓冲液:Western Blot电泳电转通用缓冲液(20329ES03),或参考Tris-Glycine缓冲液配方

3)蛋白上样缓冲液:5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(20315ES05),或参考配方1×:0.25MTris-HCL(pH6.8), 10%(W/V)SDS, 0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝), 50%(V/V) 甘油, 5%(W/V)β-巯基乙醇(2-ME)/DTT

4)其他缓冲液:PBS,TBST

2. 样本制备

1)细胞裂解液:RIPA(20101ES60,或20115ES60,或20114ES60)

2)蛋白酶抑制剂:PMSF(20104ES03)

3. 蛋白定量

1)蛋白定量试剂:BCA蛋白定量试剂盒(20201ES76)

4. 蛋白电泳

1)预制胶:4-20%高分辨率梯度预制胶,10孔(36231ES10)

2)蛋白marker:三色预染蛋白分子标准(10-245kDa)(20352ES76)

5. 转膜与封闭

1)膜(自备)

2)膜上蛋白检测:丽春红染色液(36221ES60)

3)膜的封闭:BSA,无IgG(36103ES25)

6. 抗体孵育

1)抗体:内参抗体、一抗、二抗(例:30101ES10,30401ES10,34101ES60)

2)检测试剂:ECL化学发光超敏显色试剂盒(36208ES60)

 

 

在Western Blot实验中多次提到裂解液,你足够了解他吗?

 

1.什么是RIPA裂解液?

RIPA裂解液(Radio Immunoprecipitation Assay Lysis buffer,放射免疫沉淀法裂解缓冲液)是一种传统的可用于裂解细胞或组织的快速裂解液,其原理为利用表面活性剂等裂解细胞膜(包括核膜),从组织或细胞中抽取可溶性蛋白。RIPA裂解液裂解后得到的蛋白一般可直接用于常规的WB、IP、co-IP等实验。

2.RIPA裂解液里有什么? 

RIPA裂解液的配制方法有很多种,主要包括裂解成分、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂三种组分。裂解成分可通过破坏细胞膜和蛋白间的相互作用等方式裂解组织或细胞;蛋白酶抑制剂可有效抑制各类蛋白酶的活性,避免蛋白过度降解;磷酸酶抑制剂可有效抑制去磷酸化作用。各组分具体作用见表1。

值得注意的是,由于RIPA裂解液中含有一些稳定性相对较弱的酶类抑制剂,故应放在-20℃保存。其中PMSF的稳定性极弱,半衰期只有0.5 h,所以必须现配现用。

表1.RIPA裂解液里的成分及其作用

3.RIPA裂解液有哪些种类?

目前市面上的裂解液根据其主要裂解成分等不同大致分为强、中、弱等几类。表2列举了翊圣生物提供的四种RIPA裂解液,可满足不同实验需求。

表2.翊圣生物的四种RIPA裂解液及其基本特点

4.如何选择合适的RIPA裂解液?

 如果您只是要做普通的WB、IP或者co-IP,我们建议您使用免疫印迹及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液(20118),该裂解液在裂解细胞或组织后一般不会形成粘滞的透明状DNA团块,不必采用超声处理就可进行下一步操作。同时,该裂解液还适用于磷酸化蛋白的WB检测。

如果使用免疫印迹及免疫沉淀用(WB/IP)裂解液(20118)的效果不是很好,那您的蛋白可能比较特殊,我们建议您可以尝试另外几种裂解液。如果您的蛋白是难溶性的蛋白,建议您可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,如RIPA裂解液(强/中);如果您在做IP实验的时候发现背景很高,即有很多非特异性蛋白被IP下来,这时候您需使用裂解强度较强的裂解液,比如RIPA裂解液(强/中)。反之,如果您发现目的蛋白无法IP下来,则说明您使用的裂解液强度过强,此时需使用裂解强度较弱的裂解液,比如RIPA裂解液(弱)。

5. RIPA裂解液适用于哪些细胞?

几乎适用于所有实验室培养的动物细胞和各种组织。包括各种悬浮细胞、贴壁细胞及动物组织等。

6. 如何判断细胞的裂解程度?

细胞裂解:加入RIPA后,充分裂解的细胞,没有细胞沉淀,很粘稠。如果像浑浊的水一样粘性很小则可能是裂解液得量加太多导致的;相反,如果RIPA裂解液后出现胶状物体,离心不能沉淀则可能是蛋白太多,RIPA裂解液加入的量太少导致的。

组织裂解:先将组织剪成细小的碎片,之后利用匀浆器或超声破碎的方法,镜检显示细胞破碎率大于90%,同时组织已经完全裂解,没有明显的小组织块。之后按照细胞裂解的步骤进行裂解,裂解程度的判断标准与细胞裂解一致。

RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清进行后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则需通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,如NF-κB、p53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。

7. RIPA储存出现白色沉淀,为什么?

一般是由于裂解液中SDS在储存的时候沉淀析出导致,这时只需将裂解液放置于37℃水浴加热后恢复室温即可使用。

8. RIPA裂解液可以获得细胞中的不同蛋白吗? 

RIPA裂解液提取的是全蛋白,包括核蛋白、浆蛋白、膜蛋白等。如果要提取特定的蛋白(如:核蛋白、膜蛋白)则可利用专门提这类蛋白的试剂盒进行提取。

纸上得来终觉浅,觉知此事要躬行。小翊在这里给出的建议仅供大家参考,具体裂解液的选择和使用,还需要根据您自己的实验需求和实验效果选择最适合您实验的RIPA裂解液。

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