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    Western Blot快速实验攻略

 一、Western Blot实验原理

蛋白免疫印迹(Western BlotWB)是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上,然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程,如下图所示,包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。

 

二、试剂准备

1. 各类缓冲液

1)电泳缓冲液:10xTris-Glycine-SDS电泳缓冲液20319ES76

2)电转缓冲液:Western Blot电泳电转通用缓冲液20329ES03

3)蛋白上样缓冲液:5Xsds-PAGE蛋白上样缓冲液20315ES05

4)其他缓冲液:PBSTBST

2. 样本制备

1)细胞裂解液:RIPA20101ES60,或20115ES60,或20114ES60

2蛋白酶抑制剂PMSF20104ES03

3. 蛋白定量

1蛋白定量试剂BCA蛋白定量试剂盒(20201ES76

4. 蛋白电泳

1预制胶4-20%梯度预制胶12孔(36214ES10

2)蛋白marker:三色预染蛋白分子标准(10-245kDa)(20352ES76

5. 转膜与封闭

1)膜(自备)

2)膜上蛋白检测:丽春红染色液(36221ES60

3)膜的封闭:BSA,无IgG36103ES25

6. 抗体孵育

1)抗体:内参抗体、一抗、二抗(例:30101ES1030401ES1034101ES60

2)检测试剂:ECL化学发光超敏显色试剂盒(36208ES60

三、实验步骤

1. 样本制备

1)融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM

2)贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应无没有明显的细胞沉淀。

悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成0.5-1×106个细胞/管,然后再裂解。

组织样本:按照每20 mg组织加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。

3)充分裂解后,10000-14000g离心3-5min,取上清,即可进行后续的PAGEWestern和免疫沉淀等操作。

【注】:RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,例如NF-kappaBp53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。

 

2. 蛋白定量

1)配制BSA标准品体系

标准品稀释液为蛋白样品的溶解液,原则上蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%NaCl1×PBS进行稀释。BSA标准品体系配制可参考下表。

1 BSA标准品体系配制(微孔板检测,线性范围20-2000μg/mL*

Vial

稀释液体积(μL)

2mg/mL BSA体积(μL)

BSA终浓度(μg/mL)

A

0

100

2000

B

25

75

1500

C

50

50

1000

D

125

75

750

E

150

50

500

F

350

50

250

G

375

25

125

H

395

5

25

I

400

0

0=Blank

*如用比色皿检测,每管需加100μL标准品,按3个重复计算,每个浓度至少需配制300μL

2)各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。

3)每孔加入200μL BCA工作液,振荡30s充分混匀。盖上微孔板,37℃孵育30min

4)冷却到室温,在酶标仪上的540-595nm波长范围处检测吸光度,其中562nm波长为最佳。

5)根据BSA标准品的吸光度(减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数),绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/mLY-最终的OD562nm)。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

 

3. 蛋白电泳

1)剪开包装取出预制胶,撕去胶板底端橙色胶纸,将预制胶固定在电泳槽中,内槽加满tris-glycine电泳缓冲液,外槽液面低于内槽5-10mm,双手按住梳子左右部位将其平稳缓慢(一定要慢,否则会将胶齿拔断或拔歪)拔出。

2在室温或不超过37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3)按照每4 μL蛋白样品加入1μl 5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液的比例,混合蛋白样品和5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4100℃或沸水浴加热 3-5min,以充分变性蛋白,之后冷却至室温备用。

5)在每个样品孔中上样20-40µg蛋白,并在1个孔中上样蛋白marker,盖上电泳槽盖,打开电源,推荐使用低压100V,跑15min,之后换高压150V跑,通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6)电泳后取出胶板,用镊子或小螺丝刀沿左右两板间的缝隙将两板别开,掰开两板,将胶取出,弃去塑料板,此时蛋白会从凝胶上慢慢扩散,因此不要保存在凝胶里,要迅速进行下一步的转移操作。

       

4. 转膜与封闭

1)将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。(如果检测小分子蛋白质,可省略该步骤,因小分子蛋白容易扩散)。

2)依据胶的大小剪取膜和滤纸6片,放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min,如用PVDF膜,需参照说明书,先用纯甲醇浸泡1-2min,再孵育于预冷的转膜缓冲液中。(膜的选择:0.45μm孔径,用于一般蛋白;0.2μm孔径,用于分子量小于20kD蛋白;0.1μm孔径,用于分子量小于7kD蛋白。)

3)装配转移三明治:海绵/3层滤纸///3层滤纸/海绵,每层放好后,用试管赶尽气泡。

4)将转移槽置于冰浴中,放入三明治,膜靠近阳极,胶靠近阴极,加入转移缓冲液,插上电极,100V1h(电流约为0.3A)。

5)转膜结束后,切断电源,取出膜。

6)将膜浸没在5mL丽春红染色液中,置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长,直待膜上显示出蛋白条带。注:如果没有出现染色条带,则表示转膜失败,可能需要重新转膜或重新上样电泳。

7)清洗:取出膜,用蒸馏水,PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照,大概冲洗2~3次,每次5min

8)脱色:将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min;倒去洗脱液,再重复一次。

9)清洗:再用蒸馏水清洗膜2~3次,每次5min

10)将膜置于25mL封闭缓冲液中,在室温下孵育1小时。

11)用5mL TBST洗涤三次,每次15min

 

 

5. 抗体孵育与检测

1)将膜和一抗(按照产品应用推荐稀释度)置于10mL一抗稀释缓冲液中在4°C下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2)用5mL TBST洗涤三次,每次15min以去除残留的一抗。

3)将膜和二抗(按照产品应用推荐稀释度)置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4)用5mL TBST洗涤三次,每次15min

5)最后一次洗膜的同时,按照ECL超敏试剂盒说明书,新鲜配制发光工作液。

6)用平头镊取出膜,搭在滤纸上沥干洗液,勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液(125μL发光工作液/cm2膜)中,与发光工作液充分接触。室温孵育3min,准备立即压片曝光。

7)用镊子夹起膜,搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

8)在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上,将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜,去除气泡和皱褶,可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内,蛋白带面向上。

9)暗房内压X光胶片,分别曝光不同的时间,如数秒到数分钟。显影冲洗。(从刚开始的10s曝光时间中可以看出适当的曝光时间。由于检测反应的动力学特征,在孵育后信号立即变得最强,但在随后的2小时内会减弱。)

 

三、常见问题

遇到的问题

原因分析

推荐解决方法

胶片出现反影

反应系统中HRP量过多

稀释HRP标记物

胶片出现棕色或黄色条带

荧光猝灭

操作时间过长,膜逐渐干掉

避免膜干掉

保鲜膜、显影液或定影液污染

养成良好的实验习惯

反应系统中HRP量过少

增加HRP标记物

胶片无条带显现或者信号较弱

转膜的效率低

提高转膜效率,用预染Marker判断。

抗原、抗体量少或不匹配

增加抗原/抗体量或选择合适抗原/抗体

X光胶片有问题

曝光后X光谱全黑(而非透明色),则表明胶片已完全曝光,使用新的X光片

显影/定影液有问题

可预先曝光一张胶片进行判断,如有问题当换用新的显影/定影液

反应系统中HRP量过多

稀释HRP标记物

高背景

一抗二抗浓度太高

降低抗体浓度,延长封闭时间

抗体未清洗干净

增加洗膜次数

封闭不完全

优化封闭条件

使用错误的封闭剂

使用其他的封闭剂

过度曝光

降低曝光时间

抗体特异性差

更换优质抗体

反应系统中HRP量过多

稀释HRP标记物

条带有空斑

抗原以及二抗的浓度过高

稀释样品重新跑胶,也可将混合好的显色液冰浴后,加到膜上即刻快速显色。

带型不规则

转膜有气泡或甲醇(对于PVDF膜)水化不均匀

优化转膜条件。

胶片出现斑点

HRP标记物聚集体

0.2μm膜过滤HRP标记物

非特异性条带

反应系统中HRP量过多

稀释HRP标记物

SDS引起蛋白非特异性结合

实验流程中不使用SDS

抗体特异性差

更换优质抗体

封闭不足

增加封闭时间或使用其他封闭剂

 

 



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