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    【小翊实验手帐】如何选择合适的DNA聚合酶?

 

  聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学研究的核心技术,每位生物科研工作者对其都不陌生。PCR技术的核心成份是DNA聚合酶,它是PCR反应成败的一个关键因素。目前市场上的DNA聚合酶种类繁多,常见的有:TaqCanacePfuKODPhusionPrimerstarTth等,面对众多选择,对于不了解各种DNA聚合酶特性的科研菜鸟来说,都不知该如何下手。

在选择之前,先了解一下DNA聚合酶的四个重要特点:热稳定性,保真度,扩增速度及特异性。

热稳定性 

热稳定性是指DNA聚合酶能够耐受高温的能力。不同的DNA聚合酶的热稳定性差异较大,一般通过半衰期来体现。

保真度

保真度是指DNA聚合酶精确复制DNA模板的能力。部分DNA聚合酶具有3’-5’的核酸外切酶活性能够校正错误碱基。保真度的高低可通过错配率来体现。

扩增速度

扩增速度是指在延伸时,DNA聚合酶向DNA新链中掺入核苷酸的速率。扩增速度除与DNA聚合酶有关,还会受到延伸温度,缓冲液及模板复杂程度等的影响。

特异性

特异性是指DNA聚合酶在PCR过程中只扩增目的片段的能力。为了提高PCR特异性,常通过抗体法或配体法等方式对DNA聚合酶进行修饰,使酶活性在低温条件下封闭,减少非特异性延伸和扩增。

接下来小编介绍几种常用的DNA聚合酶及其应用,您可根据实验目的不同,选择合适的DNA聚合酶。

1Taq DNA聚合酶应用:常规PCR。)

Taq DNA聚合酶来源于Thermus aquaticus,热稳定性高,在PCR循环高温条件下仍可保持较高的酶活。Taq DNA聚合酶具有良好的行进性,扩增效率高,扩增速度为30-60 sec/kb。但该酶无35核酸外切酶活性,即无校正功能,易产生错配碱基。使用该酶扩增得到的PCR产物3末端带A,可直接用于TA克隆。

2)高保真DNA聚合酶(应用:高保真PCR,如基因克隆、点突变、测序及SNP分析等。)

 

高保真DNA聚合酶是一类具有35核酸外切酶活性的酶,具有校正功能,扩增产物为平末端。当实验对保真度要求较高时,需选择此类酶。常见的高保真酶有PfuKODPhusionCanace等。不同的高保真酶在保真度,扩增速度,扩增效率等方面有所差异。一代的高保真酶的保真度较低,扩增速度较慢,如PfuKOD

翊圣生物推出了Canace高保真DNA聚合酶。该酶是基于Pfu DNA聚合酶改造而成的新一代高保真DNA聚合酶。该酶的保真性,扩增速度,扩增长度等都有了很大提升。其保真性是Taq52倍,Pfu酶的6倍,延伸速度可达15 sec/kb,可扩增20 kb的长片段,非常适合高保真PCRCanace具有极高的性价比和广泛的模板适应性,已经成为市场上热门的新产品。

3)热启动DNA聚合酶(应用:低拷贝基因扩增。)

热启动DNA聚合酶是一类提高PCR产物特异性的酶。该类酶是通过抗体法或配体法等方式对DNA聚合酶进行修饰而成,使得DNA聚合酶活性在预变性温度下才被激活。

翊圣生物根据对DNA聚合酶修饰方式的不同,将热启动酶分为两类:一类是配体法修饰的热启动酶,如HieffTM Hot Start DNA Polymerase,预变性95℃,2-3 min释放酶活;另一类是抗体法修饰的热启动酶,如UNICON™ Hot Start Taq DNA Polymerase50℃,30 min条件下仍然可以完全封闭活性。预变性95℃,30 sec即可释放酶活。使用该类酶扩增得到的PCR产物3末端带A,可直接用于TA克隆。

4Taq Plus DNA聚合酶( 应用:快速、常规PCR。)

Taq Plus DNA聚合酶是由Taq DNA聚合酶和具有35核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶按比例混合而成,具有扩增效率高和错配率低的优良性能,其扩增速度为30 sec/kb,错配率是Taq DNA聚合酶的1/6。使用该酶扩增得到的PCR产物3末端带A,可直接用于TA克隆。

5Tth DNA聚合酶(应用:常规PCRRT-PCR

Tth DNA聚合酶来源于Thermus thermophilus,具有良好的热稳定性,95℃的半衰期为20 min。该酶除DNA聚合酶活性外还具有逆转录酶活性,能催化DNARNA沿53方向发生核苷酸聚合反应,可在同一体系中完成RT-PCR。该酶无35核酸外切酶校正活性,产物为粘性末端。

产品选择指南

酶名称

合成长度

延伸速度

保真度

热启动

扩增产物

应用

HieffTM Taq DNA Polymerase

5 kb

60 sec/kb

1×

-

粘端

常规PCR 

HieffTM Taq Plus DNA Polymerase

5 kb

30 sec/kb

6×

-

粘端

快速、常规PCR 

HieffTM Long Taq DNA Polymerase

10 kb

30 sec/kb

6×

-

粘端

长片段PCR 

HieffTM Hot Start DNA Polymerase

5 kb

60 sec/kb

1×

+

粘端

低拷贝基因扩增

UNICON™ Hot Start Taq DNA Polymerase

5 kb

60 sec/kb

1×

+

粘端

低拷贝基因扩增

Hieff CanaceTM High-Fidelity DNA Polymerase

20 kb

15 sec/kb

52×

-

平端

高保真PCR