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    【小翊实验手帐】细胞活力检测,谁才是王者

        每次做MTT实验,结果一次一个样,实验重复性那么差,这样的实验数据怎么能发表……

看到纠结的童鞋,小翊也是深有同感,数据不准确,文章很头疼,怎么办?不用担心,师兄最近刚安利了一款新型的细胞增殖和活性检测试剂CCK-8,可以完全解决实验重复性差的问题。

现在让小翊来评测对比下CCK-8和MTT,谁才是王者~

原理PK

CCK-8:WST-8在电子耦合载体1-Methoxy PMS存在的情况下被线粒体内的脱氢酶还原成水溶性的橙黄色甲臜产物(formazan)。通过酶标仪测量细胞液的OD值便可检测出待测细胞样品的活性。

 

 

CCK-8细胞活性检测原理图

MTT: 是利用活细胞的线粒体脱氢酶在代谢过程中将黄色的可溶性四唑盐MTT还原为不溶于水的蓝紫色产物-甲臜(Formazan)晶体。使用合适的溶解液如DM SO溶解沉积在细胞中的甲臜晶体,通过酶标仪测量细胞液的OD值便可检测出待测细胞样品的活性。

 

MTT胞活性检测原理图

操作流程PK 

 

CCK-8和MTT操作流程图

使用MTT法进行活力检测时,生成的甲臜产物需要用DMSO溶解,颗粒不完全溶解或者在吸取上清操作过程中带走部分细胞等情况,往往会导致实验结果稳定性查、重复性差等一系列问题,有的期刊可能质疑数据的正确性。

CCK-8生成的甲臜产物是水溶性的,可直接测定OD值,不存在不完全溶解和产物被带走的情况,可以完全避免MTT法在操作上带来的误差。

 

下面分享几点小翊师兄进行CCK8细胞活力检测的经验。

1.起始细胞接种数量:以使用标准96孔板为例,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。如果检测白细胞,灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。

2.CCK-8加入剂量:一般建议为按培养体系的10%添加,添加过程中应避免产生气泡。

3.细胞孵育时间:孵育时间一般为1-4小时,一般悬浮细胞孵育的时间要长于贴壁细胞,由于CCK-8的OD值处在1.0左右是比较好的检测结果,建议实验者可以每隔0.5h测定一次OD值,以摸索出最佳孵育时间。

4.检测波长:如果没有450 nm的滤光片,可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。

5.CCK-8对细胞的毒性:CCK-8毒性非常低,检测完后相同的细胞可以继续进行其它细胞增殖检测,如结晶紫染色法、中性红染色法或DNA荧光染色法等。