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    【小翊实验手帐】The Choice of RT-qPCR:One-step or Two-step

 作为一个进实验室不久的实验小白,最近实验室师兄新购买了一步法定量试剂,而我一直使用的是“先反转录再定量”,那一步法定量试剂又是什么鬼?

 

为了跟上大师兄的脚步,不拖实验室后腿,我学习总结了以下材料。

实时定量PCRQuantitative Real-Time PCR,即qRT-PCRqPCR),是对基因和基因转录水平(即RNA)定量的重要方法。对于RNA的定量,需反转录(Reverse Transcription,即RT)和定量(qPCR)两个过程。

根据实验操作步骤的不同,可分为:One-step RT-qPCRTwo-step RT-qPCR

 

 

One-step RT-qPCR

 

实验过程:RTqPCR在同一个反应管中,可实现对RNA的直接定量。

 

实验方法优点:1、多样本基因定量:在市面上的预混液(如师兄买的小翊家的One-step RT-qPCR SYBR® Green Kit)基础上,配制含待测基因上下游引物的Mix,即可实现对不同待测样本同一基因的检测。2、污染几率低:较少的加样次数,有效降低体系配制过程中组分污染的几率;3、操作简便,节省时间。

 

考虑到RTqPCR均是酶促反应,核心酶是Reverse TranscriptaseDNA Polymerase。而两个酶促反应在同一体系下进行,必然会牺牲其中之一的性能,因此该方法存在以下缺点:1RT过程:①对模板RNA质量要求高:RNA质量的优劣严重影响逆转录效率;②模板使用量较大:一步法qRT-PCR使用基因特异性引物,而两步法qRT-PCRRT过程使用Oligo dTRandom Primer最适比例混合液作为引物,就反转录产物量而言,基因特异性引物低于Oligo dTRandom Primer;③易造成引物二聚体的形成:在37-50℃条件下,上下游引物3末端易发生退火,而Reverse Transcriptase最适酶活温度恰恰多为37-50℃。2qPCR过程:①若为染料法定量,引物二聚体会干扰定量结果;②DNA聚合酶酶活受到逆转录体系中某些组分的抑制,影响扩增效率。

 

精明的科学家们通过对RT EnzymesDNA Polymerase结构改造,优化酶反应离子环境,减少抑制成分,实现RTqPCR反应均以足够大的效率在同一体系中进行。

 

Two-step RT-qPCR

 

3.两步法RT-qPCR反应体系与过程

对于绝大多数同学来讲,是进入实验室学到的最基础最经典的实验技术。实验过程是:先RT,后qPCR,通过定量cDNA,对RNA间接定量。

 

实验方法优点:RT过程:1RNA要求宽泛:大多数RT Enzymes可使用1ng-1μg起始模板量总RNA高效率逆转录(实验室常买的是小翊家的HifairTM RT Enzymes可兼容1pg-5μg起始模板量总RNA;2、应用广泛:cDNA可用于文库构建或基因克隆等。qPCR过程:1、扩增效率高:RT过程产生的cDNA,可经5-20倍稀释,最大程度上减少对定量反应的抑制;2、高通量多基因定量:逆转录得到cDNA样品,可同时实现多个基因检测。

该方法将RTqPCR两种酶促反应分开进行,更便于RT EnzymesDNA Polymerase酶活性的释放。但分步操作会耗时较长、需多次加样移液,可能会增大产生误差和交叉污染的几率。

 

One-Step or Two-Step

 

我统计了两种方法的特点及应用,以备后续实验时,更好的选择定量方法

 

One-step Real-Time-qPCR

Two-step Real-Time-qPCR

RT反应的引物

 Gene-specific primers

 Oligo(dT) primers

 Random hexamers 

 Gene-specific

    A combination of the above

优势

1.高通量样本的基因定量

2.减少移液的次数降低污染的几率

1.RNADNA均可作为模板定量

2.定量范围宽广,检测灵敏度高

3.高通量基因定量

4.分步进行,中间产物cDNA用途广泛

5.分步进行,可优化逆转录过程和扩增过程

注意事项

1.模板RNA要求较高

2.引物要求高

3.珍稀样本不适合

1.防止多步操作带来的误差和污染

2.样本量多时,工作量大

最佳选择

1.多样本的单个基因分析

1.对单个样本进行多个目标基因的扩增

2.需要重复利用cDNA进行更多的扩增

附小翊家的产品

One-step RT-qPCR SYBR® Green KitCat.No.11125

HifairTM RT EnzymesCat.No.1111011111