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    IHC全攻略5:对照的重要性

 摘要:

  适当的对照对于IHC/ICC结果的准确阐释至关重要。令人满意的IHC/ICC实验设计可产生结果,说明抗原位于正确的组织、细胞类型或亚细胞定 位。固定、封闭、抗体孵育和抗原修复步骤的优化将产生强烈而特异的信号。然而,有时实验也会出现假象哦,蒙蔽了你的双眼。因此,IHC/ICC实验必须包 含阳性和阴性对照。

适当的对照对于IHC/ICC 结果的准确阐释至关重要。令人满意的IHC/ICC实验设计可产生结果,说明抗原位于正确的组织、细胞类型或亚细胞定位。固定、封闭、抗体孵育和抗原修复 步骤的优化将产生强烈而特异的信号。然而,有时实验也会出现假象哦,蒙蔽了你的双眼。因此,IHC/ICC实验必须包含阳性和阴性对照。

此外,抗体特异性、实验条件、组织类型之间生物学条件、甚至研究人员的差异都可能产生不一致的染色,导致不准确的结论。为了实现性能一致,详细记录是IHC/ICC研究的一个重要因素。在此,我们介绍了一些公认的对照,可支持您IHC/ICC结果的特异性。

内源组织背景对照

某些细胞和组织可能有着固有的生物学性质,产生背景染色,从而导致结果的误读。在一抗上样之前,应利用荧光(适用于荧光标记)或明视场(适用于显色标记)照明在显微镜下检查细胞和组织,以确保组织本身没有信号。例如,脂褐质是一种内源的自发荧光色素,可与阳性染色混淆。

无一抗对照

将组织与抗体稀释液孵育,其中不包含一抗的对照通常也是必需的。之后与二抗和检测试剂孵育。只用检测试剂染色应该是可以忽略的,它不会掩盖特异染色,也不会类似于特异染色的模式。

同型对照

在使用单克隆一抗时,可利用此对照。将样品与抗体稀释液孵育,并添加与一抗相同亚型(如IgG1、 IgG2A、IgG2B、IgM)和浓度的非免疫球蛋白。之后将样品与二抗和检测试剂孵育。这些步骤将确保特异染色所出现的不是由免疫球蛋白分子与样品的 非特异相互作用引起的。背景染色应该是可以忽略的,与特异染色不同。

吸附对照

为了证明抗体是与目的抗原特异结合,首先要将抗体与免疫原预孵育。这会使抗体失活,组织应该无染色或很少染 色。抗原与抗体的混合物应以10:1(摩尔比)配制,并在4 °C预孵育过夜。随后将预吸附的抗体与组织共同孵育,以取代一抗。将一抗产生的染色模式与预吸附抗体产生的相比较。

如果免疫原是肽段,那么吸附对照效果更好。不过,如果抗体是由整个蛋白产生的,则抗体与蛋白混合物的添加可 能导致更高的非特异染色。尽管机理还不清楚,但有可能是预吸附所用的抗原本身与组织结合,产生非特异染色。因此,必须注意,使用整个蛋白的吸附对照不一定 能验证抗体与组织中蛋白结合的特异性。

大鼠背根神经节中的吸附对照。A. 利用anti-human phospho-MSK1亲和纯化过的多克隆抗体(货号AF1036)对大鼠背根神经节冰冻切片中的磷酸化MSK1(S212)进行染色。B. 如果抗体用S212磷酸化免疫原预先吸附,则细胞核染色(箭头所指)不见了。

组织类型对照

IHC/ICC实验的其他对照包括使用已知表达(或不表达)目的表位的组织样品。这种策略可提供有用的参考,也可使用在初步优化研究中。来自转基因动物的组织特别有用,它们表达或不表达抗原。此外,不同物种的组织样品也可包含在内,以支持抗体的物种特异性。

Western Blot有必要吗?

人们常常开展Western blot实验,以补充或支持IHC/ICC研究。不过,在变性过程中蛋白构象的变化可能产生误导性的结果。对于某一特定抗体,Western blot与IHC/ICC研究之间的不一致可能只是反映出实验条件的差异。由于多克隆抗体识别多个表位,故没那么容易产生这种实验假象。       

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