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    IHC全攻略3:固定剂的选择

 摘要:

  理想的固定剂当然是:最好地保持细胞和组织的形态结构,并最大限度地保存抗原的免疫活性。然而,迄今为止尚无一种标准固定液能用于各种不同的抗原固 定。经同一固定液固定后,不同组织可能呈现截然不同的染色结果。因此,不同的抗原和样本必须反复试验,选择最佳的固定剂。

IHC/ICC 实验中使用的所有样本必须经过固定,以维持组织形态,并保留目的分子的抗原性。固定改变了组织的化学组成,因此往往需要在维持组织结构和保留表位之间进行 折衷。细胞或组织的不完全固定(固定不足)可能造成组织内目的蛋白的快速水解,并降低了特异的免疫反应性。然而,过度的固定(固定过度)可能导致表位的遮 蔽或强的非特异背景染色,这可能会掩盖特异的标记。

理想的固定剂当然是:最好地保持细胞和组织的形态结构,并最大限度地保存抗原的免疫活性。然而,迄今为止尚无一种标准固定液能用于各种不同的抗原固定。经同一固定液固定后,不同组织可能呈现截然不同的染色结果。因此,不同的抗原和样本必须反复试验,选择最佳的固定剂。

甲醛

甲醛是保留组织和细胞内蛋白靶点的最常用固定剂。甲醛介导的组织固定被认为依赖于蛋白-蛋白以及包含亚甲基桥(-CH2-)的蛋白-核酸交联的形成。甲醛能化学连接NH2(氨基)和CONH(肽段)基团,NH2和NH,或NH2和NH2基团。

甲醛是大多数IHC/ICC应用的良好选择,但并不是一种通用的固定剂。甲醛的固定过度会修饰氨基酸(属于 表位中的一部分),并阻断抗体与之结合。然而,在大部分情况下,利用抗原修复技术可暴露表位,以还原抗体结合。研究还表明甲醛会诱导磷酸化依赖表位的细胞 内转位,从细胞膜转移至细胞质。在这种情况下,冰预冷的无水甲醇或无水乙醇是适当的替代。

注意:甲醛溶液应当分装并冻存,或储存在4-8˚C不超过一个月。

醇类

最常用于细胞和组织固定的醇类是甲醇和乙醇。甲醇和乙醇的分子结构与水相似。因此,它们与水竞争蛋白氢键, 取代组织中的水分子。这通过降低蛋白的介电常数,使蛋白在等电点沉淀,并由于构象的改变,阻断抗体-表位的结合。尽管醇类通过打断氢键而影响蛋白的三级结 构,但它们似乎能稳定蛋白的二级结构。

不过,通常认为醇类不像甲醛固定剂那样保留组织形态。醇类不像甲醛那样渗透,主要用于固定冰冻组织切片和细胞。因此,醇类固定更适合膜表面抗原。在醇类固定之后不推荐进行抗原修复,因为它通常认为太过剧烈,有可能损害组织切片或细胞的完整性。

丙酮

丙酮是一种强的脱水剂,能引起组织蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷冻组织的切片。

组织的固定

在研究小动物如小鼠、大鼠和豚鼠的完整组织时,整个动物的灌注固定是保留抗原的最佳方法。它包括用固定液来取代动物的全身血液。然而,整个动物的灌注还不足以固定目的组织。在这些情况下,解剖的组织可浸润在固定剂中。例如,4%甲醛是组织灌注和浸润固定的常用溶液。

为了在浸润固定过程中加强固定剂的渗透,建议组织厚度不超过10 mm。对于完整的固定,固定剂的体积应当是组织体积的50-100倍。固定通常在室温下进行4-24小时。由于固定不足或固定过度可能降低或破坏组织的免疫反应性,因此优化固定条件很重要。

培养细胞的固定

与组织样本不同,培养细胞的固定时间更短,且固定液的浓度更低。例如,用2%甲醛溶液在室温下固定20分钟,常常足以保留细胞形态和抗原性。

培养细胞的固定通常只是去除培养基,并加入固定液即可。不过,去除培养基后表面张力的变化可能损害某些细胞 类型。如果是这种情况,固定剂可直接加入培养基中。例如,加入与培养基相同体积的4%甲醛,将得到2%甲醛溶液,它足以预固定细胞。在2分钟后,预固定培 养基应当替换成新鲜量的2%固定剂。预固定步骤让细胞更加坚硬,这样它们就能够承受表面张力改变所引起的任何可能的有害影响。         

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