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    免疫组化全攻略1:新手必读

 摘要:

  从技术上讲,IHC的原理很简单。首先固定样品,以保留细胞完整性,之后与封闭液共同孵育,避免抗体的非特异结合。随后将样品先后与一抗和二抗孵育, 并通过显微镜分析观察信号。然而,这并不意味着实验很好做。如何设计一个成功的IHC/ICC实验,请看免疫组化全攻略。

在上世纪30年代,免疫组织化学(Immunohistochemistry,简称IHC) 的原理就已经为人所知,但直到1942年,第一个IHC研究成果才正式发表。这也被誉为免疫荧光技术的里程碑。哈佛大学医学院的Albert Coons在《免疫学杂志》上发表文章,利用FITC标记的抗体来鉴定感染组织中的肺炎球菌抗原。1自那以后,组织固定方法、检测标记和显微镜都在不断改 进,让免疫组化成为诊断和研究中的一个必备工具。

在病理科,利用特异的肿瘤标志物,医生通过IHC诊断肿瘤是良性还是恶性,确定肿瘤的分期和分级,并确定细胞类型和转移的来源,以便找到原发肿瘤的位置。同样,IHC也能用于药物开发,通过检测疾病靶点的上调或下调来判断药物疗效。

免疫组化指的是根据抗体与抗原特异结合的原理来检测组织切片中的抗原(如蛋白)。immuno的词根来自操作中所使用的抗体,而histo意味着组织。另一种类似的技术是免疫细胞化学(Immunocytochemistry,简称ICC)。这两个词大家经常混着用,看着好像差不多,但实际上还是有点区别。这里顺便说说。

IHC vs. ICC

对于IHC,组织是来自患者或动物,经过冷冻或石蜡包埋。将这些组织制成约4μm厚的切片,封片后再处理。通过这种方法,研究人员可观察细胞组分的定位,同时维持周围组织的原先结构。

对于ICC,大部分细胞外基质及其他基质组分被去除,只剩下整个细胞来染色。ICC的来源可以是细胞悬液,来自患者或动物(如血涂片、拭子等),或在实验室中进行的组织培养细胞系。

除了生物学来源,IHC和ICC在样品处理的程度上也有所不同。ICC需要透化,要么通过固定过程,要么是 单独的透化步骤,这样抗体才能与细胞内的靶点相结合。而IHC可能不要单独的透化步骤,这取决于切片的厚度和固定方法。包埋在石蜡中的IHC切片必须进一 步处理,才能进行抗体染色。一旦处理好样品,IHC和ICC的染色操作就几乎没什么差异了。当然,就染色而言,根据所使用的抗体来优化还是少不了的。

设计一个成功的IHC/ICC实验

从技术上讲,IHC的原理很简单。首先固定样品,以保留细胞完整性,之后与封闭液共同孵育,避免抗体的非特异结合。随后将样品先后与一抗和二抗孵育,并通过显微镜分析观察信号。

然而,这并不意味着实验很好做。最大的挑战在于如何确定最佳的实验条件,让每个抗原都产生强烈而特异的信 号。如果是个高丰度蛋白,那么挺好办,需要的固定时间短,封闭时间短,可以用荧光标记一抗直接检测。但如果要检测冰冻切片中的磷酸化蛋白呢?那可能需要抗 原修复,外加放大检测。

R&D Systems的网站列出了IHC/ICC实验设计和优化的变量,如下表。

变量

因素

抗原

物种、表达水平、样品类型 & 亚细胞定位

表位

取决于构象和翻译后修饰

样品类型

组织或细胞

样品制备

组织:石蜡或冰冻

细胞:贴壁细胞或细胞悬液

适当对照

无一抗、同型对照、吸附对照、组织类型对照

固定方法

灌注或浸泡

固定剂

甲醛、醇类或丙酮

封闭液

正常血清、牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉

抗原修复

蛋白酶诱导的表位修复(PIER)或热诱导的表位修复(HIER

检测方法

直接或间接(有无放大)

一抗

单克隆或多克隆

二抗

物种和标记

标记方法

荧光或显色

标记

荧光染料、DABAEC

复染剂

荧光:DAPI

显色:苏木精

封片剂

荧光:抗淬灭封片剂

显色:水性封片剂

观察&分析

荧光显微镜或标准的光学显微镜

 

看完这些,是不是觉得有些头晕呢,这么多地方需要优化。其实也没那么恐怖,生物通接下来会发布一些优化指 南,包括如何制备样品,如何选择固定剂,如何优化抗体检测等,千万别错过。此外,R&D Systems等网站也公布了免疫组化的基本操作,以及检测特定抗原的具体条件,可供您参考。(生物通 薄荷)

参考文献

1. Albert H. Coons, Hugh J. Creech, R. Norman Jones & Ernst Berliner. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody. J. Immunol. 1942 45: 159-170.                   

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