7×24小时 服务热线:400-6111-883  翊圣微信:
产品名称: Reactive Oxygen Species Assay Kit 活性氧(ROS)检测试剂盒
  • 产品货号:50101ES01
  • 产品规格:1 Kit (1000 tests)
  • 产品价格:
  • 类别:氧化应激相关
   
  • 产品简介
  • 实验数据
  • 文档资料
  • 相关产品
  • 论文发表
  •  产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    储存

    价格(元)

    Reactive Oxygen Species Assay Kit 活性氧(ROS)检测试剂盒

    50101ES01

    1 Kit (1000 tests)

    -20

    965.00

    检测原理

    活性氧检测试剂盒Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种基于荧光染料DCFH-DA2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate)的荧光强度变化,定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。

    DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜。进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不会通透细胞膜,因此探针很容易被积聚在细胞内。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。在最大激发波长480 nm,最大发射波长525 nm处,使用荧光显微镜,流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号Rosup为活性氧阳性诱导药物,根据其荧光信号强度,可分析活性氧的真正水平。

    96孔板每孔加样量为标准本试剂盒可测定1000次。

    产品组分

    编号

    组分

    规格

    保存方法

    50101-A

    DCFH-DA10mM

    0.1 mL

    -20

    50101-B

    活性氧阳性对照(Rosup, 100mM

    1.0 mL

    -20

    运输与保存

    冰袋运输。-20干燥保存,避免强光直射。有效期年。

    检测步骤

    1.装载探针

    1.1 原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)

    细胞准备:检测前一天进行细胞铺板,确保检测时细胞汇合度达到50~70%

    】:必须保证细胞状态健康,且检测时不会过度生长。

    药物诱导:去除细胞培养液,加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物37细胞培养箱内避光孵育,具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。

    (可选)阳性对照先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM常用工作浓度100 μM,加入细胞,一般37避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。【如,HeLa细胞孵育30 minMRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h

    探针准备探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM

    探针装载吸除诱导用药物,加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。如,对于6孔板通常不少于1000 μL,对于96孔板通常不少于100 μL37细胞培养箱内避光孵育30 min

    细胞清洗:用无血清培养液洗涤细胞1~2次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA

     1.2 收集细胞后装载探针:适用于贴壁细胞和悬浮细胞。

    细胞准备按照标准方法培养细胞,必须保证检测用细胞状态健康。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞。

    药物诱导将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物,于37细胞培养箱内避光孵育具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。

    (可选)阳性对照先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM常用工作浓度100 μM,加入细胞,一般37避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。【如,HeLa细胞孵育30 minMRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h

    探针准备探针装载前,按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM

    探针装载去除细胞内药物,离心收集细胞,加入适当稀释好的探针,使其细胞密度为1.0×106~2.0×107。【】:细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法,以及检测总量来进行调整。如,对于流式分析,单管检测内细胞数目不少于104,也不可多于106。每隔3-5 min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。

    细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA

    2检测

    原位装载探针法:激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

    收集细胞后装载探针:用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

    3参数设置

    使用488 nm激发波长,525 nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测DCFDCF的激发光谱和发射光谱参考下图。

    其他事项说明

    1对于刺激时间较短(通常2 h以内)的细胞,也可先装载探针,后用活性氧阳性对照和/或感兴趣药物刺激细胞,如阳性对照刺激,应先加入适量探针于37℃避光孵育30 min;然后再加入等体积2×阳性对照Rosup溶液(200 μM),37℃避光诱导30 min-4 h

    2)阳性对照Rosup通常浓度为100μM通常刺激后30 min-4 h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞,活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 min内观察不到活性氧的升高,可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快,可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。

    3对于某些细胞,如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可以按照1200015000稀释DCFH-DA,使装载探针时DCFH-DA的浓度为25 μM。探针装载的时间也可以根据情况在1560 min内适当进行调整。

    4活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品,并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

    注意事项

    1) 探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。

    2) 探针装载完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的装载情况是否良好。

    3) 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差。

    4) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。