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产品名称: SulfoLink Coupling Resin 巯基蛋白琼脂糖偶联树脂
  • 产品货号:20511ES08
  • 产品规格:5ml
  • 产品价格:
  • 类别:蛋白表达与纯化
   
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    产品名称          

    产品编号

    规格

    储存

    价格(元)

    SulfoLink Coupling Resin  巯基蛋白琼脂糖偶联树脂

    20511ES08

    5ml

    4

    928.00

    SulfoLink Coupling Resin  巯基蛋白琼脂糖偶联树脂

    20511ES25

    25ml

    4

    2388.00

    SulfoLink Coupling Resin  巯基蛋白琼脂糖偶联树脂

    20511ES60

    100ml

    4

    8548.00

    产品描述

    SulfoLink Coupling Resin是一类预活化树脂,其纯化原理在于可以通过与巯基或者氨基的反应实现抗原的固定化,进而利用抗原抗体的特异性反应对免疫血清中的抗体进行高效纯化,是多克隆抗体生产中不可缺少的纯化介质。

    产品性质

    基质(Matrix

    4%琼脂糖

    配体(Ligand

    碘乙酸

    孔径(Bead size

    45-165µm

    载量(Capacity

    3mg IgG/ml 基质

    最大流速(Flow velocitymax

    0.1Mpa,1bar

    pH范围(pH range

    5-10

    储存缓冲液(Buffer

    1M NaCl

    运输和保存方法

    冰袋运输。4保存。

    注意事项

    1SulfoLink Coupling Resin使用前一定要充分颠倒若干次,使琼脂糖珠混合均匀。

    2)所有操作过程中,样本需要在4或冰上操作。

    3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    使用方法

    针对巯基和氨基的偶联条件有所差异,请分别进行选择。

    1含巯基抗原的偶联流程

    1.1 缓冲液准备

    所用水和 Buffer 在使用之前建议用0.22 μm0.45μm滤膜过滤。

    偶联液:50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5

    封闭液:50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸,pH 8.5

    保护液:20 mM PBS20%乙醇,pH 8.0

    结合/洗杂液:20 mM PBSpH 8.0

    洗脱液:100 mM 甘氨酸,pH 2.5-3.0

    中和液:1 M Tris-HCl, pH 8.5

    1.2  抗原准备

    使用偶联液溶解抗原,制备成终浓度为 1-3 mg/ml 的抗原溶液。建议该溶液现用现配,储存时间过长会影响偶联效果。

    【注】: 抗原样品使用前务必确保其巯基处于还原状态(可以使用 DTNB(Ellmans Reagent), Yeasen Cat#60306)检测自由巯基的含量)。如果巯基已经氧化,必须对抗原进行还原,一般推荐使用还原剂 TCEPTris(2-carboxyethyl)phosphine, Yeasen Cat# 20330),TCEP 溶液很稳定,可以选择性的、高效的打开抗原中的二硫键,并且不影响抗原与树脂的偶联反应,每毫克抗原中 TCEP 的添加量不超过12mg,具体使用量需要自行优化。

    如果使用 DTT 等含有巯基的还原剂,处理完样品必须要将还原剂去除,否则会影响抗原与树脂的偶联效率。

    1.3抗原偶联

    1)取适量SulfoLink Coupling Resin,加入到合适的重力柱中,靠重力流干保护液,用3倍柱体积的偶联液平衡树脂,待偶联液流干,再加入3倍柱体积的偶联液,重复操作 2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。

    2)关闭柱子的下端出口,加入等体积的含巯基的抗原,混匀,取出至合适的离心管中,置于28震荡孵育30min

    【注】:确保树脂充分悬浮起来,否则将大大影响偶联效率。

    3)将上述反应体系取出,转移至重力柱中,流干其中溶液,并收集流出液,再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂,合并两次流出液。

    【注】:如有需要,可以使用 Ellman’s Reagent 检测其中巯基含量,得出抗原残留量,从而计算偶联效率。

    4)关闭柱子的下端出口,加入等体积的封闭液,混匀,转移至合适的离心管中,于28震荡孵育30min

    5)将上述反应体系取出,转移至重力柱中,流干其中的封闭液。

    【注】:如果立即使用,可以参考【抗体纯化】操作。如果以后使用,可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂,然后保存在等体积的保护液中,于 4冰箱保存。

    1.4  抗体纯化

    1)将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱,用5倍柱体积的结合液进行平衡,使填料处于与抗体更易结合环境中,一方面保护目标抗体,另一方面提高抗体结合效率。

    2)将含有抗体的样品加到平衡好树脂中,为了保证抗体与树脂充分接触,提高目标抗体的回收率,可以控制上样流速在0.5-1 ml/min,并收集流出液。

    3)用10-15倍柱体积的洗杂液进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,提高目的抗体的纯度,收集洗杂液。

    4)使用5-10倍柱体积的洗脱液,收集洗脱组分,即目的抗体。

    【注】:为了保持抗体活性,需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0-8.0的缓冲液中,或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液,将洗脱组分进行中和,再透析。

    5)依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂,最后再用5倍柱体积的保护液平衡,然后保存在等体积的保护液中,置于4保存,防止填料被细菌污染。

     

    含氨基抗原偶联流程

    2.1 缓冲液准备

    所用水和 Buffer 在使用之前建议用 0.22µm0.45µm滤膜过滤。

    偶联液:0.1 M NaHCO30.5 M NaClpH 8.5

    封闭液:50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸,pH 8.5

    保护液:20 mM PBS20%乙醇,pH 8.0

    结合/洗杂液:20 mM PBSpH 8.0

    洗脱液:100 mM 甘氨酸,pH 2.5-3.0

    中和液:1 M Tris-HCl, pH 8.5

    2.2抗原偶联

    1)使用偶联液溶解抗原,制备成终浓度为5-10 mg/ml的抗原溶液。

    2)取适量SulfoLink Coupling Resin,加入到合适的重力柱中,靠重力流干保护液,用3倍柱体积的偶联液平衡树脂,待偶联液流干,再加入3倍柱体积的偶联液,重复操作2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。

    3)关闭柱子的下端出口,加入等体积的含氨基的抗原,混匀,取出转移至合适的离心管中,置于 28震荡孵育3-5h,或者4震荡孵育过夜(12-15h)。

    【注】:确保树脂充分悬浮起来,否则将大大影响偶联效率。

    4)将上述反应体系取出,转移至重力柱中,收集流出液,再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂,合并两次流出,待测试。

    5)关闭柱子的下端出口,加入等体积的封闭液,混匀,取出转移至合适的离心管中,置于28震荡孵育30min

    6)将上述反应体系取出,转移至重力柱中,流干其中的封闭液。

    【注】:如果暂不使用,可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂,然后保存在等体积的保护液中,于4保存。

    2.3 抗体纯化

    1)将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱,用5倍柱体积的结合液进行平衡,使填料处于与抗体更易结合环境中,一方面保护目标抗体,另一方面提高抗体结合效率。

    2 将含有抗体的样品加到平衡好树脂中,为了保证抗体与树脂充分接触,提高目标抗体的回收率,可以控制上样流速在 0.5-1 ml/min,并收集流出液。

    3)用10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,提高目的抗体的纯度,收集洗杂液。

    4)使用5-10倍柱体积的洗脱液,收集洗脱组分,即目的抗体。

    【注】:为了保持抗体活性,需要立即将洗脱组分透析至pH7.0-8.0的缓冲液中,或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液,将洗脱组分进行中和,再透析。

    5)依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂,最后再用5倍柱体积的保护液平衡,然后保存在等体积的保护液中,置于4保存,防止填料被细菌污染。

    3  SDS-PAGE 检测

    将纯化抗体样品得到的流出组分、洗杂组分和洗脱组分以及原始含抗体样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

     

    4 问题与解决方案

    出现问题

    原因

    推荐解决方案

    柱子流速低

    筛板被堵塞

    清洗或更换筛板

    样品或填料中有气泡

    轻轻搅拌填料或敲击层析柱去除气泡

    偶联液中蛋白或多肽沉淀

    蛋白或多肽不溶

    偶联液中加入<30%DMSODMF6M盐酸胍促进样品溶解

    偶联效率低

    样品无巯基,被氧化

    加入DTTTCEP后立即交联

    洗脱组分纯度低

    树脂没有彻底清洗

    增加结合/洗杂液体积

     

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