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    一气呵成,Hieff Clone攻无不“克”

Yeasen Hieff CloneTM 一步法克隆试剂盒荣登SCI顶尖期刊:《CellScience.

详情点击:http://www.yeasen.com/CompanyNews/1930.htm

          http://www.yeasen.com/CompanyNews/1951.htm

基于限制性内切酶和T4 DNA连接酶的经典分子克隆技术,易出现假阳性,克隆效率不高。此外,该技术受到多种实验因素的限制,包括酶切位点的选择、插入片段制备繁琐、T4 DNA连接酶序列的偏好性、连接反应时间长等。

提高克隆效率的关键,增加配对碱基数

 

1. 几种克隆方法连接效率的比较

翊圣生物经数年潜心研究,精益求精。摸索与优化反复循环,实现了末端同源重组技术由理论到应用的升级,研发出Hieff CloneTM系列克隆产品。该系列产品克隆效率显著提升,可达95%以上。基于同源重组的方式,该系列产品无需考虑酶切位点,适用于任何载体和任意片段的连接。同时兼具连接反应时间短(20 min)、操作简单等优势。

非凡匠心,带来极致品质

翊圣生物在成熟的工具酶表达纯化平台基础上,获得高纯度重组酶,并反复优化重组酶反应微环境,保证Hieff CloneTM克隆试剂盒的最佳品质。它可以将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。Hieff CloneTM克隆试剂盒简便、快速、高效,是无缝克隆的首选。

产品优势

无需考虑酶切位点:不受插入片段酶切位点的限制,适用于任何载体;插入片段兼容粘性或平末端。

设计简单:在插入片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

快速高效:50℃20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

应用广泛:可用于单片段或多片段定向克隆,也可结合Canace高保真酶,应用于定点突变。

方法对比

方法

目的片段制备步骤

酶切位点

通用性

连接时间

阳性率

一步法同源重组

仅需1

不受目的片段限制

20 min

95%以上

传统酶切酶连

需要2

受到目的片段限制

过夜

不同基因差别大

 

实验流程

Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒分为单片段克隆和多片段克隆试剂盒,实验流程见下图。

 

2Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒进行单片段和多片段克隆实验流程图。

线性化载体的制备:酶切或PCR制备线性化载体。插入片段的制备:在目的DNA片段上下游引物的5’端引入20 bp左右载体末端同源序列;PCR反应扩增目的片段。重组反应:按比例混合线性化载体和目的DNA片段进行重组,50℃反应20 min转化、涂板:将重组产物直接转化后涂平板。挑取克隆。

产品数据

 单片段高效重组

 

3Hieff CloneTM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同长度的单片段基因。

A-D:重组转化平板。E:插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H:插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体:pFastBac14.7 kb,插入片段大小分别是1.2 kb3 kb5 kb,载体与插入片段摩尔比:1:3,重组反应条件:50℃20 min

 多片段轻松重组

 

4Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit进行三片段克隆。

A:重组转化平板。B:插入片段和载体浓度检测电泳图。CPCR方法鉴定每个单片段和最终连接基因。箭头指示目的条带。载体:pCAMIBA130210 kb,三个插入片段长度:1 kb1.5 kb2.5 kb,重组反应条件:50℃20 min

 载体与插入片段摩尔比1:3左右最适

 

5Hieff CloneTM One Step Cloning Kit进行单片段和载体不同摩尔浓度比例重组克隆测试。

A-C:重组转化平板。载体与插入片段的分子摩尔数比分别是1:2A),1:3B)和1:4C),重组反应条件:50℃20 min

 重组反应时间20-30 min最佳

 

6Hieff CloneTM One Step Cloning Kit进行不同重组反应时间克隆测试。

A-C:重组转化平板。重组反应时间分别是20 minA),25 minB)和30 minC),重组反应温度:50℃

客户反馈

 超高的阳性率

 

7:使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆,阳性率100%

A:重组转化平板。B:克隆基因PCR鉴定电泳图。载体:10 kb,插入片段:300 bp,载体浓度:50 ng/μL,插入片段浓度:50 ng/μL,载体与插入片段摩尔比例为1:1,重组反应条件:50℃20 min(中国科学院植物生理生态研究所)

 低浓度载体重组

 

8:使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆。

A:重组转化平板。B:载体浓度检测电泳图。C:插入片段浓度检测电泳图。D:克隆基因PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体4.7 kb,插入片段1.6 kb,载体浓度:5 ng/μL,插入片段浓度:25 ng/μL,载体与插入片段摩尔比例为1:2,重组反应条件:50℃20 min(西南大学)

高性价比

 

 

9Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit与不同品牌的同类产品相比,显示出更高的性价比。

客户使用情况

已得到广大用户认可——使用客户数量600+

主要有:中国科学院上海生命科学研究院,北京大学,中国农业大学,清华大学生命科学学院,华东理工大学,上海交通大学,复旦大学,华中农业大学,浙江大学,中国药科大学,武汉大学,中山大学,东南大学,南京林业大学,华南农业大学,南京农业大学,南方医科大学,山西师范大学,中国农业科学院中国水稻研究所,中国科学院水生生物研究所,暨南大学,中科院健康科学研究所,中国科学院动物研究所,华东师范大学,同济大学,中国科学院微生物研究所,第二军医大学,上海市东方医院,上海植物逆境生物学研究中心,中国农业科学院上海兽医研究所,中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,浙江大学医学院附属第二医院,中国科学院植物研究所,中国科学院南京土壤研究所,中国科学院遗传与发育生物学研究所,中国科学院上海有机化学研究所,中国科学院生物物理研究所,中国科学院南海海洋研究所,中国林科院亚热带林业研究所,浙江省农业科学院等单位的课题组。

常见问答

QHieff CloneTM克隆的原理是什么?

A:利用末端同源重组的原理。将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。

Q:与传统克隆相比,Hieff CloneTM克隆有什么优势?

A1)无需考虑酶切位点:不受插入片段酶切位点的限制,适用于任何载体;插入片段兼容粘性或平末端。

2)设计简单:在插入片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

3)快速高效:50℃20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

4)应用广泛:可用于单片段或多片段定向克隆,也可结合Canace高保真酶,应用于定点突变。

Q:同源序列长度对重组效率的影响?

A:同源序列的长度与克隆数目有相关性,一般同源片段选择在20 bp左右,可以在15 bp-25 bp范围内调整。并且选择尽量避免出现二级结构。

Q:线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗?

A:线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应,建议割胶回收纯化产物。

Q:一步法快速定向克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗?

A:推荐使用转化效率为108 cfu/μg的感受态细胞。如YeasenDH5αcat NO. 11802ES),TOP10cat NO. 11801ES)等。

Q:线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例?

A载体使用量应大于0.01 pmol,推荐使用量0.03 pmol;克隆载体与目的片段摩尔比应在2:1-1:5范围内,最适1:2-1:3,超过范围可能会影响克隆效率。

Q:一步法快速定向克隆试剂盒适用实验有哪些?

A:本试剂盒适用于绝大多数基于常规酶切-连接方法的克隆实验,并且特别适用于其它常规方法难以快速实现的基因多点突变、全基因合成等。

Q:多片段一步法快速定向克隆试剂盒可以用于单片段的克隆吗?

A:多片段一步法克隆试剂盒可以用于单片段的克隆。但是,单片段克隆试剂盒不建议用于多片段的克隆,重组效率可能会受到影响。

Q:一步法快速定向克隆试剂盒反应温度是50℃,是否可以在37℃进行反应?

A:一般情况下建议在50℃进行反应。50℃有利于消除DNA的二级结构,同时是Hieff CloneTM重组酶的最适反应温度。37℃反应条件也可以进行重组反应,请根据实验需要进行优化。

产品发表文献

[1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017. 中科院植物生理生态研究所,王二涛组)

[2]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16.(中科院生物化学与细胞生物学研究所陈玲玲组)

[3]. Zhu T, Zhao Y, Wu Y, et al. The Staphylococcus epidermidis gdpS regulates biofilm formation independently of its protein-coding function[J]. Microb Pathog, 2017,105: 264–271.(皖南医学院)

[4]. Li N, Hong T, Li R, et al. Cherry Valley Ducks Mitochondrial Antiviral-Signaling Protein-Mediated Signaling Pathway and Antiviral Activity Research[J]. Front Immunol, 2016,7:377.(山东农业大学)

[5].Ma, Y., et al., miR-1908 Overexpression Inhibits Proliferation, Changing Akt Activity and p53 Expression in Hypoxic NSCLC Cells[J]. Oncol Res, 2016. 24(1): p. 9-15.西安交通大学

[6].Yan, X., et al., The New Synthetic H2S-Releasing SDSS Protects MC3T3-E1 Osteoblasts against H2O2-Induced Apoptosis by Suppressing Oxidative Stress, Inhibiting MAPKs, and Activating the PI3K/Akt Pathway[J]. Front Pharmacol, 2017. 8: p. 07.西安交通大学

[7].Lu, J., et al., Tiron Inhibits UVB-Induced AP-1 Binding Sites Transcriptional Activation on MMP-1 and MMP-3 Promoters by MAPK Signaling Pathway in Human Dermal Fibroblasts[J]. PLoS One, 2016. 11(8): p. e0159998.上海交通大学

[8].Wu, R., et al., Direct regulation of the natural competence regulator gene tfoX by cyclic AMP (cAMP) and cAMP receptor protein (CRP) in Vibrios[J]. Sci Rep, 2015. 5: p. 14921.中国疾病控制与预防中心

 [9].He, D.X., et al., A methylation-based regulatory network for microRNA 320a in chemoresistant breast cancer[J]. Mol Pharmacol, 2014. 86(5): p. 536-47.江南大学

 

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活动信息:

本活动针对货号为10911或10912的克隆试剂盒,体验价为150元/个,体验数量总共为300个。

注:

1.购买人员仅限新客户,以个人为单位,不限课题组。

2.每人仅限订购一盒。

3.该活动解释权仅限翊圣生物所有。

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