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产品名称: T4 DNA Ligase (5 U/μl)
  • 产品货号:10300ES80
  • 产品规格:1000 U
  • 产品价格:
  • 类别:内切酶/修饰酶
   
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    产品名称

    产品编号

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    价格(元)

    T4 DNA Ligase (5 U/µl)

    10300ES80

    1000 U

    -20

    425.00

    产品描述

    T4 DNA LigaseATP做辅酶的情况下可催化dsDNA 平末端或粘性末端相邻核酸的5’磷酸末端和3’羟基末端形成磷酸二酯键,还可催化RNA和双链中的ssDNA RNA 链连接,但不能催化全单链核苷酸间的连接。

    本品主要适用于标记RNA 3’-末端,环化RNADNA寡聚核苷酸以及克隆cDNA等核酸操作。

    产品组分

    组分编号

    组分名称

    规格1000 U

    10300-A

    T4 DNA Ligase (5 U/µl)

    200 µl

    10300-B

    10× Ligase Buffer

    2 ml

    运输和保存方法

    冰袋运输。-20保存。

    单位定义

    20 μl的连接反应体系中,6 μgλDNA-Hind  分解物在16下反应30 min时,催化50%以上的DNA片段发生连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)

    质量控制

    核酸外切酶残留检测:2000 U的本品和0.6 μg λ-Hind III74下反应1小时,DNA的电泳谱带不发生变化。

    核酸内切酶残留检测:2000 U的本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA74下反应1小时,DNA电泳谱带不发生变化。

    注意事项

    1Buffer在融解时,如果出现少量沉淀属正常现象,请颠倒混匀后使用。

    2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

     使用方法

    1. 在无菌微量离心管中配制以下反应体系:

    组分

    使用量

    载体DNA

    50-100 ng

    插入片段

    片段与载体的分子摩尔比应在3:1-5:1

    10× Ligase Buffer

    2 µl

    T4 DNA Ligase (5 U/µl)

    1 U

    ddH2O

    To 20 µl

    注:平末端载体与DNA片段进行连接时,应首先将载体进行去磷酸化处理,以防发生自连接现象。为提高连接效率,每20 µl反应体系中可以加2 µl 50% PEG 4000

    2. 16反应过夜

    3. 转化实验

    1)将连接产物加入到100 µl 感受态细胞中(连接产物不应超过感受态细胞的1/10),轻弹混匀,冰上孵育30 min

    2)将离心管于42,热激90 sec(不要晃动),之后立刻置于冰水浴静置2-3 min

    3)向离心管中加入900 µl LBSOC培养基,37150 rpm,振荡培养45 min,该过程使菌体复苏,抗性基因表达。

    42500 g 离心5 min,吸去900 µl上清,用剩余培养基重悬菌体,用无菌涂布棒将剩余菌体在正确抗性的平板上涂布均匀,待菌液被平板吸收后,37倒置培养过夜。

    如果使用超级感受态细胞(转化效率>108 cfu/µg),可直接吸取100-200 µl 37孵育后的菌液涂板,剩余菌液可在4保存,1周内均可重新涂板。

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