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产品名称: Protein A/G Agarose Resin 4FF 蛋白A/G琼脂糖快速纯化树脂
  • 产品货号:36404ES08
  • 产品规格:5ml
  • 产品价格:
  • 类别:IP/Co-IP
   
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    价格(元)

    Protein A/G Agarose Beads 4FF  快速蛋白A/G琼脂糖珠

    36404ES08

    5ml

    4

    978.00

    Protein A/G Agarose Beads 4FF  快速蛋白A/G琼脂糖珠

    36404ES25

    25ml

    4

    3186.00

    Protein A/G Agarose Beads 4FF  快速蛋白A/G琼脂糖珠

    36404ES60

    100ml

    4

    8726.00

    产品描述

    天然蛋白AProtein A是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白,天然蛋白GProtein G)是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白,二者功能相似,主要通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc区相互作用,可结合大多数哺乳动物的IgG。然而两者结合特异性上有所不同(详细见附录1,蛋白AG对不同物种Ig的结合能力总表),如蛋白G对人IgG3,大鼠IgG2a,绵羊IgG1具有很高的亲和力,但蛋白A对这些Ig结合力很弱。蛋白A,蛋白G常共价偶联在固体载体如琼脂糖珠或丙烯酸树脂小珠上,直接用以做免疫沉淀(IP)或者免疫共沉淀(Co-IP)来进行蛋白功能相关研究,或者直接装在层析柱上来纯化单克隆或者多克隆抗体。

    本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G,不仅维持其本身的Ig亲和特性,同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本品同时将蛋白A和蛋白G共价偶联到琼脂糖凝胶微球表面,比单独的蛋白A或者蛋白G都有更广的结合范围,适合于所有蛋白A琼脂糖珠和蛋白G琼脂糖珠单独可以结合的Ig,实用性更高。

    产品性质

    基质(Matrix

    高度交联的4%琼脂糖微球

    配体(Ligand

    重组蛋白A/G

    孔径(Bead size

    45-165µm

    最大流速(Flowmax

    0.3MPa,3bar

    储存缓冲液(Buffer

    20%乙醇的1×PBS

    载量(Capacity

    20mg human IgG/ml 基质

    pH范围(pH range

    3-10

    运输与保存方法

    冰袋运输。4保存,2年有效。

    需准备试剂

    【注】:建议以下缓冲液在使用前用0.22μm0.45μm滤膜过滤。

    结合/洗杂缓冲液:0.15M NaCl, 20mM Na2HPO4, pH7.0

    洗脱缓冲液:0.1M甘氨酸,pH 3.0

    中和液:1M Tris-HClpH 8.5

    交联缓冲液:0.2M 三乙醇胺,pH8.2

    终止液:50mM Tris-HClpH 7.5

     

     

     


    使用方法

    一、免疫沉淀(ImmunoprecipitationIP:

    1蛋白样品的准备:

    贴壁细胞:取10 cm细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤2次,然后加入500 µl2 ml细胞裂解液裂解细胞(如RIPA裂解液);

    悬浮细胞:离心收集细胞后,PBS洗涤1次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解;

    动植物组织样本:参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解;

    【注意】:a)具体的裂解方法,应参考不同裂解液的详细使用方法;b)不同量的细胞,应选用适当裂解液的用量进行裂解(如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量),通常裂解液最终总蛋白浓度选择在0.5-1ug/ul范围内较合适;c可选:细胞或组织处理时加入广谱核酸酶BenzonaseYeasen Cat#20125),能够降解所有形式的DNARNA(单链、双链、线形和环状),而无蛋白水解活性。此步操作可以降低背景,保障实验的可重复性。

    2 去除非特应性结合(可选):

    0.2-1 ml 细胞或组织裂解液,蛋白量约为0.2-1 mg,加入约1 µg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG20 µl充分重悬的Protein A/G Agarose Resin 4FF4缓慢摇动30 min~2 h

    2500 rpm(约1000g)离心5min,取上清用于后续的免疫沉淀。

    【注】:所谓种属相同的IgG是指与后续免疫沉淀用一抗宿主相同的正常IgG。此步骤可以预先去除样本与Protein A/G Agarose Resin 4FF的非特异性结合,降低背景。

    3 免疫沉淀:

    1)抗体吸附

    取适量Protein A/G Agarose Resin 4FF加入到2ml离心管中,500rpm离心1min,吸弃上清。

    加入0.5ml结合缓冲液重悬树脂,500rpm离心1min,吸弃上清。继续重复2次此操作。

    向上述已平衡树脂中加入抗体溶液,重悬树脂,室温下轻轻翻转离心管或置于翻转混合仪混匀30min后,500rpm离心1min,收集上清液,备用,待检测。

    向上述树脂中加入0.5ml的洗杂缓冲液,重悬树脂对其进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,500rpm离心1min,吸弃上清。再重复2次。

    2)抗体交联(可选)

    【注】:如需将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略此步骤。

    向清洗过的树脂中加入1ml交联Buffer500rpm离心1min,吸弃上清。

    再向其中加入1ml 20mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交联Buffer,该试剂需现配现用,重悬树脂,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转,促使Buffer 和树脂充分接触,30min后,500rpm离心1min,吸弃上清。

    再向其中加入1ml终止液,重悬树脂,终止交联反应,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转15min500rpm离心1min,吸弃上清。

    加入0.5ml洗杂缓冲液,重悬树脂,进行清洗,500rpm离心1min,吸弃上清。再重复2次。

    3)沉淀反应

    抗原吸附:向上述树脂-抗体溶液中加入含抗原的样品,用移液器轻轻吹打使抗原与树脂-抗体复合物分散均匀,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转10min,使抗原与抗体充分结合,如结合力较弱则可在室温下反应1h或者在4下反应过夜。

    洗杂:将上述完成抗原吸附的产物500rpm 离心1min,收集上清液置于冰上待检测。向离心管中加入1ml洗杂缓冲液,用移液器轻轻吹打使树脂-抗体-抗原复合物分散均匀,500rpm离心 1min,弃上清。重复2次,最后加入1ml洗杂液,将树脂-抗体-抗原复合物转移至新的离心管中,500rpm离心1min吸弃上清。

    4 样品洗脱

    【注】:根据后续检测的不同提供两种洗脱方法。

    1 变性洗脱:该方法适于SDS-PAGE检测。向上述离心管中加入25µl 1×SDS-PAGE loading buffer 混匀,95加热5min500rpm 离心1min,收集上清进行后续WB分析。


    2)非变性洗脱:该法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后续功能分析。具体做法:向上述沉淀反应得到的树脂-抗体-抗原复合物中加入5倍体积的洗脱Buffer,用移液器轻轻吹打数次,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转10min500rpm离心1min,吸取上清,收集洗脱组分,即为目标抗原,将其收集至新的离心管中,立即加入1/10体积的中和液,将洗脱组分PH调至7.0-8.0,备用。

    二、免疫共沉淀 Co-IP

    1 抗原抗体的结合:将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合,室温孵育30-60min,或者4孵育过夜。

    【注】: 该步骤孵育时间取决于抗原与抗体的结合效率以及抗原的稳定性,需根据具体情况进行优化; 抗体的加入量需参考后续加入树脂的量,抗体加入量过多会导致抗原-抗体混合物与树脂的结合。推荐抗体加入量为树脂80%的最大载量。

    2 树脂准备:

    1)取适量Protein A/G Agarose Resin 4FF加入到2ml离心管中,500rpm离心1min,吸弃上清。

    2)加入0.5ml结合Buffer 重悬树脂,500rpm离心1min,吸弃上清。继续重复2次此操作。

    3 抗原-抗体混合物的吸附:将步骤1中抗原-抗体混合物加入到已处理的树脂中,混匀,室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转30min,使其充分接触并吸附,500rpm离心1min,收集上清留待检测。

    4 洗杂:向上述离心管中加入0.5ml洗杂缓冲液,重悬树脂,去除非特异性结合,500rpm离心1min,吸弃上清。再重复2次此操作。

    5 抗原洗脱(根据后续检测的目的提供两种抗原洗脱方法,同免疫沉淀法洗脱)

    注意事项

    1)请勿冷冻保存本产品。

    2Protein A/G琼脂糖珠使用前一定要充分颠倒若干次,使琼脂糖珠混合均匀。

    3)所有操作过程中,样本需要在4或冰上操作。

    4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

     

    附录  蛋白AG对不同物种Ig的结合能力总表(见下)

    免疫球蛋白亚型

    Protein A

    Protein G 

    免疫球蛋白亚型

    Protein A

    Protein G 

    Human IgG

    ++++

    ++++

    Mouse IgG

    ++++

    ++++

    Human IgG1

    ++++

    ++++

    Mouse IgG1

    +

    ++++

    Human IgG2

    ++++

    ++++

    Mouse IgG2a

    ++++

    ++++

    Human IgG3

    +

    ++++

    Mouse IgG2b

    +++

    +++

    Human IgG4

    ++++

    ++++

    Mouse IgG3

    ++

    +++

    Human IgM

    Use anti-Human IgM

    Mouse IgM

    Use anti-Mouse IgM

    Human IgE

    NR

    NR

    Chicken IgG (IgY)

    NR

    NR

    Human IgA

    +

    NR

    Cow IgG

    ++

    ++++

    Human IgA1

    +

    NR

    Goat IgG

    +

    ++++

    Human IgA2

    +

    NR

    Goat IgG1

    +

    ++++

    Human IgD

    Use anti-Human IgD

    Goat IgG2

    ++++

    ++++

    Rat IgG

    +

    ++

    Goat IgM

    NR

    NR

    Rat IgG1

    NR

    +

    Guinea Pig IgG

    ++++

    ++

    Rat IgG2a

    NR

    ++++

    Guinea Pig IgG1

    ++++

    ++

    Rat IgG2b

    NR

    +

    Guinea Pig IgG2

    ++++

    ++

    Rat IgG3

    +

    ++

    Hamster IgG

    +

    ++

    Sheep IgG

    +

    ++

    Horse IgG

    +

    ++++

    Sheep IgG1

    +

    ++

    Rabbit IgG

    ++++

    +++

    Sheep IgG2

    +

    ++

    Rabbit IgM

    NR

    NR

    Sheep IgM

    NR

    NR

    Rabbit All isotypes

    +++

    ++

    Pig IgG

    +++

    +++

    Monkey IgG

    ++++

    ++++

    Cat IgG

    ++++

    +

    Donkey IgG

    ++

    ++++

    Dog IgG

    ++++

    +

     

     

     

    (+)= weak binding; (++)= moderate binding; (++++)= strong binding; NR= not recommended; (-)= not tested;

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