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产品名称: Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒
  • 产品货号:11004ES10
  • 产品规格:10 rxn
  • 产品价格:
  • 类别:基因突变
   
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    Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒

    11004ES10

    10 rxn

    -20

    1228.00

    产品描述

    Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit是基于Hieff CloneTM快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒,可一次性向目标质粒上三至五个不连续位点(相距超过50bp同时引入定点突变。该试剂盒由两个模块组成:HieffTM II Pfu DNA Polymerase扩增模块和Hieff CloneTM快速克隆模块。HieffTM II Pfu DNA Polymerase超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性,其卓越的长片段扩增能力,广泛适用于长度小于20 kb的任何质粒扩增。Hieff CloneTM快速克隆系统利用高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应。因此使用Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit进行DNA定点突变时,引物设计更加灵活,且扩增反应以指数方式进行,极大减少了模板使用量,有利于原始甲基化模板的彻底降解。

    Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit中的重组酶Exnase MultiS经过优化,专门针对碱基进行定点突变。此外,如扩增产物特异,其DpnI消化产物可不进行DNA纯化而直接用于重组反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及极高的成功率,使得Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit成为DNA点突变首选试剂盒。

    应用范围

    DNA定点突变

    如使用本品对质粒进行定点突变,请使用甲基化酶无缺陷的宿主菌 (例如Top10DH5αJM109)扩增原始质粒!

    产品组成

    编号

    组分

    产品编号/规格

    11004ES10 10 T

    11004-A

    2×HieffTM II PCR buffer 

    1.25 ml

    11004-B

    dNTP Mix (10 mM each)

    50 μl

    11004-C

    HieffTM II Pfu DNA Polymerase (1 U/μl)

    50 μl

    11004-D

    Dpn I (10 U/μl)

    50 μl

    11004-E

    2× Hieff Clone MultiS Enzyme Premix

    100 μl

    运输与保存方法

    冰袋(wet ice)运输。产品-20 ºC保存。有效期1年。


    不连续多碱基(相距超过50bp)定点突变实验流程(以不连续三碱基为例)

    实验流程概览(图一)

    图一:使用Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit进行不连续三碱基定点突变实验流程


    1.引物设计

    向质粒三个不连续位点引入定点突变,只需设计对引物将质粒分段扩增即可。引物设计基本原则为:在每个待突变位点处设计部分反向互补的扩增引物对。每对正反向引物5’端包含15-21 bp反向互补区域GC含量40%-60%为佳),各引物待突变位点至引物3端区域Tm值高于60为佳。所需引入突变可以包含在互补区域内 (需要两条引物上均引入点突变),也可以包含在任一条引物的非互补区域 (只需在一条引物上引入点突变),请勿将突变位点置于引物末端。以向pUC18引入碱基突变为例,引物设计具体方案如图二所示。

     

    图二:向质粒引入不连续多碱基定点突变引物设计示意图

    【注】:待突变位点BC处的正反向扩增引物设计方式与位点A 处的引物设计方式一致。计算引物Tm值时,应计算待突变位点至引物3端这一区域内的碱基,待突变位点至引物5端区域内的碱基不应参与计算。

    2.目标质粒分段扩增

    以待突变位点ABC为界,将质粒分为ABBC段和CA段。使用HieffTM II Pfu DNA Polymerase对各段分别进行扩增。AB段扩增引物对为:待突变位点A正向扩增引物和待突变位点B反向扩增引物;BC段扩增引物对为:待突变位点B正向扩增引物和待突变位点C反向扩增引物;CA段扩增引物对为:待突变位点C正向扩增引物和待突变位点A反向扩增引物。

    2.1 配制PCR反应体系

    反应各组分解冻后请充分摇匀,使用完毕后及时放回-20℃。2×HieffTM II PCR buffer请勿长时间敞口放置。

    为了增加扩增特异性,反应体系配制过程请于冰水浴中进行。为了防止HieffTM II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物,请将聚合酶最后加入反应体系中。推荐反应体系如下:

    ddH2O

    Up to 50 μl

    ×TM II PCR buffer

    25 μl

    dNTP Mix (10 mM each) a

    1 μl

    模板DNA b

    Optional

    引物1 (10 μM)

    2 μl

    引物2 (10 μM)

    2 μl

    HieffTM II Pfu DNA Polymerase (1 U/μl) c

    1 μl

    a. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。

    b 各片段能正常扩增的前提下,应尽量减少质粒模板使用量,推荐≤1 ng待扩增质粒长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解,因此推荐使用新鲜制备的质粒作为模板。

    c. 推荐的酶的终浓度为1 U/50 μl反应。可将HieffTM II Pfu DNA Polymerase0.5-2 U/50 μl之间进行优化,但不要超过2 U/50 μl,尤其当扩增子长度大于5 kb时。


    2.2 PCR扩增反应

    推荐PCR反应条件:

    循环步骤

    温度

    时间

    循环数

    预变性

    95

    30 sec

    1

    变性a

    退火b

    延伸c

    95

    60℃~72

    72

    15 sec

    15 sec

    30-60 sec/kb

    30 d

    彻底延伸

    72

    5 min

    1

    a. 对于大多数质粒,变性温度使用95℃即可。

    b. HieffTM II Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。

    c. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。长的延伸时间有助于提高扩增产量。

    d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变,强烈建议扩增循环数35。如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数应30

    反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测。如目标质粒正确扩增,则可进行下步实验。

    3.扩增产物DpnI消化,去除甲基化模板质粒

    上述扩增产物中包含原始模板质粒,为防止其在转化后形成假阳性转化子,必须在进行重组环化之前进行DpnI消化。

    推荐反应体系如下:

    DpnI

    1 μl

    扩增产物

    4050 μl

    将上述反应体系置于37℃恒温反应12小时。如产物扩增特异,产物条带单一,DpnI消化产物无需纯化,可直接用于后续重组反应。如扩增不特异,DpnI消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物。

    4.重组反应

    4.1 配制重组反应体系

    质粒ABBCCA段扩增产物末端分别包含相对应的完全一致的一段序列,因此在Exnase MultiS催化下扩增产物末端可以发生同源重组,完成扩增产物环化过程。于冰水浴中,将下列组分依次加到无菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎将液体粘在管壁,请务必通过短暂离心使其沉入管底。体系配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)

    ddH2O

    Up to 20 μl

    ABDpnI消化产物

    x ng

    BCDpnI消化产物

    x ng

    CADpnI消化产物

    x ng

    2× Hieff Clone MultiS Enzyme Premix

    10 μl

    Exnase MultiS点突变重组反应体系最适DNA使用量为每片段0.03 pmol。该摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得:

    DpnI消化产物最适使用量 = [0.02 × 目标质粒碱基对数] ng (0.03 pmol)

    例如,AB段长度为1 kbBC段长度为2 kbCA段长度为5 kb。则DpnI消化产物最适使用量为:AB0.02 × 1000 = 20 ngBC0.02 × 2000 = 40 ngCA0.02 ×5000 = 100 ng 

    DNA量太多或者太少都将降低环化效率。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响,测定值和DNA实际浓度往往偏差较大。因此,请务必通过琼脂糖电泳预先确认DNA浓度,尽量严格按照推荐量配制反应体系。当DpnI消化产物最适使用量计算值不足10 ng或者超过200 ng时,加入10ng200 ng即可。DpnI消化产物不纯化直接用于重组反应时,使用量不应超过反应总体积的1/5,即4μl

    4.2 重组反应

    1) 将上述体系置于50℃反应 20-50 min

    2) 待反应完成后,立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min

    3) 之后,反应产物可直接进行转化;也可储存于-20℃,待需要时解冻转化。

    5.反应产物转化、涂板、克隆鉴定

    1) 10 μl冷却反应液,加入到100 μl感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置30 min

    242℃热激4590秒,冰水浴孵育2 min

    3) 加入900 μl SOCLB培养基,37℃孵育10min充分复苏。

    437℃摇菌45 min

    5) 100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置,于37℃过夜培养。

    我们推荐您使用转化效率>108 cfu/μg的感受态细胞。如果感受态转化效率<108 cfu/μg (例如用CaCl2法新鲜制备的感受态转化效率通常在106-107 cfu/μg之间),请将培养菌液在5,000 rpm离心3 min收集菌体,用100 μl LB培养基重悬后全部涂板。

    注意事项

    1)引物设计时5’端反向互补区尽量选择无重复序列,且GC含量比较均匀的区域。当这一区域内GC含量在40%60%范围之内时,重组环化效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%,重组环化效率会受到较大影响。

    2) 当两突变位点相距小于50bp时,应将其视为一个突变位点,将两突变引入同一条/对引物进行实验。

    3DpnI只能识别甲基化DNA,请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板。

    4) 质粒PCR扩增结果需高度特异,杂带较多会影响实验结果。

    5) 重组反应体系中应尽量避免金属络合剂(EDTA)的带入。因此,建议将DNA纯化产物溶解在pH8.0ddH2O中保存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0ddH2O替代),请勿使用TE进行DNA保存。

    6) 冷却后的反应产物应在1h内进行转化,且转化前保持在冰水浴中。如需储存,于-20℃冻存。尽量避免室温较长时间放置或4℃长期储存。

    7) 反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10,否则会降低转化效率。另外,当转化的DNA浓度太高时,会抑制转化反应。将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。

    8) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。