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产品名称: Endpoint Chromogenic LAL Assays 终点显色鲎分析试剂盒
  • 产品货号:60402ES32
  • 产品规格:32T
  • 产品价格:
  • 类别:检测试剂盒
   
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    价格(元)

    Endpoint Chromogenic LAL Assays 终点显色鲎分析试剂盒

    60402ES32

    32T

    4避光

    1866.00

    Endpoint Chromogenic LAL Assays 终点显色鲎分析试剂盒

    60402ES58

    80T

    4避光

    3866.00

    产品描述

    鲎试剂(Limulus amebocyte lysate, LAL)为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

    本试剂盒的检测原理是:在适宜的条件下(温度,pH值及无干扰物质),细菌内毒素激活C因子,引起一系列酶促反应,进而激活凝固酶原形成凝固酶,凝固酶分解人工合成的显色基质,使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺(pNAλmax = 405nm)。在一定时间内,pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关,据此,可以定量供试品的内毒素浓度。同时,对硝基苯胺(pNA)也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色(λmax = 545nm),避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。

    按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1EU/ml0.01EU/ml-0.1EU/ml两个区间(反应时间T1T2见出厂检验报告)。

    产品组分

    编号

    组分

    产品编号/规格

    60402ES3232T

    60402ES5880T

    60402-A

    细菌内毒素工作品

    15EU×2

    15EU×5

    60402-B

    鲎试剂

    1.7ml×2

    1.7ml×5

    60402-C

    显色基质

    1.7ml×2

    1.7ml×5

    60402-D

    偶氮化试剂1

    10ml×2

    10ml×5

    60402-E

    偶氮化试剂2

    10ml×2

    10ml×5

    60402-F

    偶氮化试剂3

    10ml×2

    10ml×5

    60402-G

    HCl (反应终止剂)

    50ml×1

    50ml×2

    60402-H

    细菌内毒素检查用水

    50ml×2

    50ml×5

    60402-I

    无热原配件(离心管/吸头)

    5×1

    10×1

    运输与保存方法

    冰袋运输。产品4避光保存。

    需准备的材料和设备

    无热原试管、无热原吸头。漩涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。恒温水浴箱(37±1)、分光光度计。

    供试品的贮存与预处理若供试品为血液类,请参照我司配套血液相关处理试剂使用说明书)

    1. 供试品的pH值应在6-8之间,若超出此范围,需用无热原缓冲液、0.1M氢氧化钠或0.1M盐酸调节。

    2. 若供试品中可能存在鲎实验的干扰物质,处理参见【供试品的干扰试验】。

    3. 若供试品中可能含有β-葡聚糖(其会产生G因子旁路反应,干扰内毒素检测),需选用特异性鲎试剂(我公司提供)。

    4. 若供试品为一些抗菌素如头孢类抗菌素和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应而干扰偶氮化显色,需要选用不含偶氮化试剂的试剂盒(我公司提供)。

    5. 若供试品的本底吸光度值大于0.5必须对供试品进行稀释后再检测。

    6. 若供试品颜色较深(例如溶血),或在酸性条件下颜色加深(例如一些组织培养介质),必须设置供试品空白管以扣除供试品自身的颜色本底。供试品空白管不加入鲎试剂,以等体积鲎试剂的溶剂(该处为细菌内毒素检查用水)代替。其余操作同供试品管。

    操作方法

    1. 细菌内毒素标准溶液配制

    1) 溶解取细菌内毒素工作品1支(15EU/支),加入1ml细菌内毒素检查用水(BET水),复溶后置漩涡混匀器上混匀15min,混匀时要防止液体溅出。BET水最大加入量不得超过1ml。该浓度为15EU/ml

    2 稀释15EU/支规格的细菌内毒素母液需稀释成10EU/ml,再进行不同浓度的标准品工作液配制

    A以内毒素梯度浓度:0.10.250.51.0EU/ml为例说明:

    0.2ml 10EU/ml的标准品,加入1.8ml BET水,终浓度为1.0EU/ml以此为母液按下表稀释成等比例浓度梯度。配制好的内毒素标准溶液应在4小时内用完。

    注:每步稀释均需在漩涡混匀器上混匀30s

    内毒素标准溶液配制

    内毒素浓度(EU/ml)

    1

    0.5

    0.25

    0.1

    加细菌内毒素检查用水(ml)

    0

    0.5

    1.5

    0.9

    1EU/ml内毒素溶液(ml)

    1

    0.5

    0.5

    0.1

    B其余梯度浓度视情况而定。每一步稀释的稀释倍数不得超过10倍。

    2. 阴性对照为细菌内毒素检查用水。

    3. 鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂等的溶解

    鲎试剂:按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中,轻轻振摇使鲎试剂完全溶解,注意不要用旋涡混匀仪激烈振摇。溶解的鲎试剂应在10分钟内用完。

    显色基质:按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中,轻轻振摇使显色基质完全溶解。显色基质溶液可在无污染的条件下于4贮存8小时以内。

    偶氮化试剂1:按标示量加反应终止剂HCL于偶氮化试剂1

    偶氮化试剂2:按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂2

    偶氮化试剂3:按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂3

    偶氮化试剂溶液可于4贮存1周。

    4. 实验操作

    1) 取无热原试管,加入100μl 细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液,或供试品。

    2) 再加入100μl 鲎试剂溶液,混匀,37温育T1分钟。

    3) 温育结束,加入100μl 显色基质溶液,混匀,37温育T2分钟。

    4) 温育结束,加入500μl 偶氮化试剂1溶液,混匀。

    5) 加入500μl偶氮化试剂2溶液,混匀。

    6) 加入500μl偶氮化试剂3溶液,混匀,静置5分钟,于545nm波长处读取吸光度值见表2

    实验操作

     

    阴性对照

    内毒素标准

    供试品

    加细菌内毒素检查用水(μl)

    100

     

     

    加内毒素标准溶液(μl)

     

    100

     

    加供试品(μl)

     

     

    100

    加鲎试剂(μl)

    100

    100

    100

    混匀,37温育T1 分钟

     

     

     

    加显色基质溶液(μl)

    100

    100

    100

    混匀,37温育T2 分钟

     

     

     

    加偶氮化试剂1溶液(μl)

    500

    500

    500

    混匀,加偶氮化试剂2溶液(μl)

    500

    500

    500

    混匀,加偶氮化试剂3溶液(μl)

    500

    500

    500

    混匀,静置5分钟,于λ545nm读取吸光度值

    500

    500

    500

    (上述T1T2见该批鲎试剂的出厂检验报告)

    数据处理

    建立标准曲线:Y = b X + a

    其中Y545nm处吸光度值,X为内毒素的浓度,b为直线斜率,aY轴截距。

    当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效:

    1. 标准曲线的相关系数r≥ 0.980

    2. 标准曲线最低点的Y值大于阴性对照的Y值;

    3. 供试品平行管的平均值在标准曲线的区间内。

    【供试品的干扰试验】

    供试品的干扰试验详见《中华人民共和国药典》2010版中《细菌内毒素检查法》的光度测定法干扰试验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须进行干扰试验。

    步骤如下:

    1. 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm),作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度,配制含λm内毒素的供试品阳性对照溶液,测量出该溶液的内毒素浓度,称为Cs

    2. 测量出未添加外源内毒素的供试品溶液内毒素浓度称为Ct

    3. 计算该试验条件下的回收率R(Cs–Ct)/λm×100%

    4. R50%200%之间,则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

    5. R50%200%之外,需对供试品进行系列稀释(稀释倍数不得超过最大有效稀释倍数MVD)或进行其它处理消除干扰每一稀释溶液都重复步骤1-3,直到内毒素的回收率R50%200%之间。选择回收率R最接近100%的稀释倍数进行内毒素检测。

    注意事项

    1. 该试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测,严禁试剂以任何途径进入机体。

    2. 接触试剂及供试品的所有器皿必须是除热原的,玻璃器皿可经250干烤至少60分钟去除热原。试验过程应防止微生物的污染。

    3. 该说明书中的除热原指内毒素浓度小于0.005EU/ml

    4. 稀释的内毒素溶液静置时间超过10min,用前需在涡旋混合器上剧烈混匀1min

    5. 当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时,须进行干扰试验,参见【供试品的干扰试验】。

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